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1.
采用PCR技术检测分离自广西钦州、北海和防城港3市凡纳滨对虾样品中的67株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)3种毒力基因tdh、trh和tlh的携带情况,并将tlh基因进行原核表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,67株副溶血弧菌均未扩增出tdh和trh基因,而tlh基因检出率为100.0%,所检副溶血弧菌的毒力基因型为tdh~-trh~-tlh~+。成功构建了原核表达质粒pET-28a-tlh,将其转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测得到大小约为53 kDa的产物,与预测值相符。经Western blotting鉴定,该重组表达产物能与抗6×His标签的单克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
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凡纳滨对虾细菌性红体病病原的分子特征与耐药性 总被引：1，自引：1，他引：0
为探明引起凡纳滨对虾细菌性红体病的病原,从病虾肝胰脏分离得到10株优势菌,经回归感染实验证实其为引起此次红体病的病原菌.Vitek与16S rRNA序列分析显示,分离株均为副溶血弧菌.基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)表明,这些菌株形成3个新序列型(ST),其中1株为ST413,7株为ST414,2株为ST415;ST413包含新等位基因型recA-166与tnaA-121,ST414则含有新等位基因型gyrB-219.MLST结果提示,这些副溶血弧菌分离株并非来自单一克隆,呈现出一定水平的分子多样性.但这些菌株均含有大流行群(PG)的分子标记toxRS与VPA1168,并具有相同的毒力基因构成(tlh+ tdhtrh-T3SS1+T3SS2-)与耐药谱,其tdh与trh的缺失并未影响细菌对凡纳滨对虾的致病力.综上所述,引起此次凡纳滨对虾红体病的10株副溶血弧菌可能为PG的不同变异株. 相似文献
3.
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海水养殖中常见的条件致病菌,具有发生率高和流行面广等特点。本文从患红体病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内分离得到一株细菌HNBX-1,经生化实验结合热休克蛋白60(Heat Shock Protein 60,HSP60)基因鉴定为副溶血弧菌。毒性实验表明,弧菌HNBX-1对凡纳滨对虾的毒性极强,感染24 h时的LD50为3.5×104cfu·mL-1;对其重要毒力基因———耐热溶血毒素基因(TDH)、耐热溶血毒素相关基因(TRH)和Ⅲ型分泌系统(T3SS1和T3SS2)的分析结果显示,HNBX-1中的TDH、TRH以及T3SS2基因检测结果均为阴性,而T3SS1的4个毒力基因中的VP1689(vscK)和VP1694(vscF)基因扩增为阳性,表明该副溶血弧菌菌株的强毒特性与其携带的T3SS1密切相关。 相似文献
4.
为了解对虾养殖池中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐药性和毒力基因的携带情况,2018年从山东4个地区的对虾养殖池收集分离副溶血弧菌,采用Kirby-Bauer纸片法检测其对12种抗生素的耐药性,用PCR方法检测其携带耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)的情况。从对虾养殖池共分离副溶血弧菌50株。药敏实验结果显示,副溶血弧菌对庆大霉素、硫酸新霉素和氨苄西林的耐药情况最为严重,耐药率分别高达98%、90%和86%,对氟苯尼考、氯霉素、头孢他啶等敏感性较高,耐药率分别为10%、10%和20%。88%的菌株具有多重耐药性。毒力基因检测结果显示,所有菌株均不携带tdh基因,4%的菌株表现为trh阳性。本研究表明,对虾养殖水环境中的副溶血弧菌对抗生素的耐药性较为严重,应加强副溶血弧菌的病原学监测,在养殖过程中合理使用抗生素,以实现水产养殖业健康发展。 相似文献
5.
为查明上海市奉贤区某对虾养殖场疑似患急性肝胰腺坏死病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的病原菌，本研究从患病凡纳滨对虾肝胰腺组织分离纯化到1株优势菌FHBX-1,并通过人工回归感染试验确定其致病性，利用VITEK-2全自动微生物鉴定仪和16S rRNA、热休克蛋白HSP60基因序列分析进行综合鉴定，并检测其毒力基因。同时采用K-B纸片扩散法检测病原菌的药物敏感性并通过石蜡切片观察患病凡纳滨对虾肝胰腺组织的病理特征。结果显示：菌株FHBX-1经生理生化特征测定、16S rRNA和热休克蛋白HSP60基因序列分析，综合鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）,且携带了急性肝胰腺坏死病相关的毒力基因pirAVP、pirBVP,未携带副溶血弧菌临床主要毒力基因耐热直接溶血毒素tdh和相对耐热直接溶血毒素trh基因。人工回归感染试验结果显示，凡纳滨对虾在菌液浓度为1.0×106 CFU/mL浸泡感染试验组，7 d内累计死亡率为80%,患病凡纳滨对虾具有肝胰腺颜色变白、萎缩变小，胃肠变... 相似文献
6.
本研究从患急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中分离到一株优势菌,编号为20160303005-1,通过16S rRNA和分子伴侣蛋白groEL基因序列分析,并结合生理生化特征,将该细菌鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),其血清型为O1:KUT(K untypeable)。基因分析结果显示,该菌株携带可引起对虾AHPND的相关毒力蛋白基因pirA~(VP)和pirB~(VP),但不携带副溶血弧菌临床菌株毒力基因:耐热直接溶血毒素(Thenmostable direct hemolysin,tdh)和相对耐热直接溶血毒素(TDH-related hemolysin,trh)基因。菌株对凡纳滨对虾具有较强的致病性,浸泡感染的半数致死剂量(LD_(50))为7.96×10~3 CFU/ml。对虾急性感染后,6 h肝胰腺颜色变浅,肠胃变空;9 h肝胰腺呈浅白色,萎缩变小。9 h死亡数过半,24 h全部死亡。组织病理学分析显示,感染后对虾肝胰腺小管崩塌,上皮细胞严重脱落,呈现出典型的AHPND病理症状。药敏实验结果显示,该菌对庆大霉素、环丙沙星和头孢他啶等16种药物敏感,对阿莫西林、替卡西林和头孢噻吩等5种药物表现为耐药。上述研究可为该病原的流行病学及药物防控研究提供基本数据。 相似文献
7.
为研究凡纳滨对虾死亡的致病机理,实验采用TCBS培养基从濒死凡纳滨对虾肝胰腺分离到浅绿色、直径3～7 mm的发荧光菌落;革兰氏染色为阴性短杆菌;经API20E鉴定,分离株PvL-1与坎氏弧菌参考菌株CAIM249相似度为90%;fitZ序列与坎氏弧菌CP020076相似度为99.31%;gapA序列与坎氏弧菌EF596552相似度为98.89%;采用坎氏弧菌种特异性引物对PvL-1进行PCR分析,可扩增出坎氏弧菌种特异性片段,不能扩增出轮虫弧菌和哈维氏弧菌特异性片段,上述结果表明PvL-1为坎氏弧菌成员。分离菌株在10%脱纤维羊血平板呈β溶血,脱脂奶粉平板出现明显透明圈,表明存在溶血性和胞外蛋白酶活性。分析了PvL-1的急性肝胰腺坏死病、溶血素基因、菌毛基因和其他毒力基因,表明PvL-1具有AP4、TLH、vcahHly、flaC、mukF、gloB、sodB和esrB等毒力基因。PvL-1可使健康凡纳滨对虾发病死亡,濒死凡纳滨对虾与自然发病虾呈现类似症状,对凡纳滨对虾半数致死浓度(LD50)2.94×104 CFU/尾;病理组织观察发现,人工感染发病凡纳滨对虾肝胰腺小管细胞脱落、崩解、血细胞浸润等,与自然发病凡纳滨对虾病理特征相同。研究表明,本次实验分离到可发光的坎氏弧菌PvL-1,对凡纳滨对虾有较强致病性,拓展了对凡纳滨对虾发光坎氏弧菌的认知。 相似文献
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饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾抗感染和5种免疫基因表达的影响 总被引：4，自引：1，他引：3
为研究饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力和非特异性免疫基因表达水平的影响,以初体质量为(6.95±1.20)g的凡纳滨对虾为研究对象,在室内养殖箱进行3周的养殖实验和2周的副溶血弧菌人工感染实验;其中,对照组每日投喂普通商品饲料,实验组每日投喂在普通商品饲料中添加地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌(1:1)配制成的3组实验饲料,实验饲料中益生菌的终浓度为107 cfu/g。并采用实时荧光定量RT-PCR方法,对保护率最高的地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌实验组进行凡纳滨对虾相关免疫基因表达水平的分析。实验结果表明,在饲料中添加单一益生菌或复合益生菌均可显著提高对虾抗副溶血弧菌感染的能力(P<0.05),且复合益生菌的保护效果更佳,其相对免疫保护率为31.11%。感染副溶血弧菌后,地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌实验组凡纳滨对虾血淋巴中的先天免疫缺陷基因(innate immune deficiency gene,IMD)、对虾素3a分子(penaiedin 3a)、酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)和甲壳素Crustin的mRNA的相对表达量均显著上调,且分别在18～24 h达到最大值。实验结果提示:饲料中添加芽孢杆菌可有效提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的能力,这种能力的提高可能是通过增加抗病相关基因的表达量实现的。 相似文献
9.
采用RACE技术克隆凡纳滨对虾黏着斑激酶基因,利用相关软件工具拼接、比对其序列,构建进化树,同时利用荧光定量技术分析了该基因的组织分布和合并感染下的免疫应答。试验结果显示,凡纳滨对虾黏着斑激酶基因cDNA序列全长4919bp,ORF片段长3036bp,编码1012个氨基酸。凡纳滨对虾黏着斑激酶基因具有蛋白激酶特征结构域PTK和C端的对虾黏着结构域。荧光定量结果表明,凡纳滨对虾黏着斑激酶基因表达无组织特异性,眼部表达量最高,肌肉中表达量最低,可以被副溶血弧菌与白斑综合症病毒以及二者的合并感染诱导表达,表达量先升再降,整个试验过程中合并感染组斑激酶表达量总是高于白斑综合症病毒单独感染组。酶活测定结果表明,合并感染组酸性磷酸酶活力变化最活跃;试验后期,弧菌单独感染组碱性磷酸酶活力始终高于合并感染组,合并感染组过氧化物酶活力总是高于白斑综合症病毒单独感染组;整个试验过程中,弧菌单独感染组超氧化物歧化酶活力始终高于其他两个感染组。 相似文献
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水体使用副溶血弧菌噬菌体对对虾体内宿主的防治研究 总被引：5，自引：0，他引：5
研究在水体使用噬菌体对感染病原菌对虾的治疗效果。在水体使用浓度分别为1×106,1×105,1×104pfu/mL的噬菌体对人工感染副溶血弧菌的凡纳滨对虾进行生物防治实验。结果显示,施加噬菌体的实验组对虾的死亡率明显低于对照组,对虾发病症状也较轻。凡纳滨对虾各组织器官含菌量实验表明,噬菌体对水体宿主裂解的同时,对虾体内器官的副溶血弧菌也被明显清除。水体中加入噬菌体使感染副溶血弧菌对虾体内的血细胞含量保持相对稳定。水体使用噬菌体对对虾副溶血弧菌病有积极的治疗作用。 相似文献
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《水产科学》2013,(8)
测定和分析了海水和淡水养殖的凡纳滨对虾肌肉常规营养成分、氨基酸含量和脂肪酸组成。试验结果表明,海水养殖凡纳滨对虾肌肉中粗蛋白和粗灰分含量显著高于淡水养殖凡纳滨对虾(P0.05),而水分的含量显著低于淡水养殖凡纳滨对虾(P0.05);海水养殖凡纳滨对虾氨基酸总量、必需氨基酸量、鲜味氨基酸总量均显著高于淡水养殖凡纳滨对虾(P0.05);海水和淡水养殖凡纳滨对虾肌肉中均含有丰富的不饱和脂肪酸,总量分别达68.48%和69.80%,但海水虾肌肉中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸总量显著高于淡水虾(P0.05),而多不饱和脂肪酸总量显著低于淡水虾(P0.01);海水虾肌肉中n-3多不饱和脂肪酸总量亦显著低于淡水虾(P0.05),表明在海水环境中凡纳滨对虾合成n-3多不饱和脂肪酸的能力较差。综合分析表明,海水养殖凡纳滨对虾肌肉的营养价值和风味稍优于淡水养殖凡纳滨对虾。 相似文献
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凡纳滨对虾红体病病原菌间接ELISA快速检测方法的研究 总被引：10，自引：1，他引：10
以凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌的ELISA技术。采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为106CFU·mL-1和1∶2000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达75.88%;交叉反应和阻断实验结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了30份人工感染后的凡纳滨对虾和健康凡纳滨对虾,阳性检测率分别为93.3%和13.3%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着重要意义。 相似文献
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本研究筛选了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道铁载体高产菌株,并探究了饲料中添加铁载体高产菌株对凡纳滨对虾的生理功效。结果显示,从凡纳滨对虾肠道中筛选出一株铁载体产量高达74.87%的菌株SDVGH3,经鉴定属于泛菌属(Pantoea sp.),产生的铁载体属于异羟肟酸型,该菌株无溶血性,对大部分抗生素敏感;优化了该菌株铁载体产量的培养条件：最适温度为28℃,pH为7.5,盐度为0,装液量为10 mL,Fe3+浓度为0.01 mmol/L;采用滤纸片扩散法检测了菌株抑制病原菌的特性,显示能抑制5种凡纳滨对虾致病菌。通过在饲料中添加SDVGH3菌液,凡纳滨对虾增重率和饲料利用率明显升高,血细胞数量、吞噬率和血浆酚氧化酶、抗菌活性均有不同程度的升高,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒后,实验组的死亡率显著低于对照组,1010 CFU/g实验组的死亡率最低,为61.4%;添加107 CFU/g SDVGH3菌液处理组,凡纳滨对虾肠道菌群多样性显著提高,弧菌属(Vibrio sp.)在肠道菌群中所占比例明显下降。研究表明,铁载体高产菌株SDVGH3能明显促进凡纳滨对虾生长、免疫防御能力,增强肠道菌群健康,具有应用于水产养殖中的潜力。 相似文献
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利用噬菌体防治对虾弧菌病的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用副溶血弧菌人工感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),以口服和直接浸泡副溶血弧菌噬菌体两种方式处理对虾,9天内,实验组对虾的死亡率较弧菌对照组低66.7%,实验组对虾的组织器官中和实验水体中的弧菌含量均远低于弧菌对照组.实验结果表明:口服和直接浸泡副溶血弧菌噬菌体方式均可有效防治对虾弧菌病. 相似文献
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副溶血弧菌对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性和基因表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对凡纳滨对虾(Litopanaeus vannamei)肝胰腺抗氧化酶活性及相关基因表达的影响,本研究选取始体重(2.20±0.24)g的健康凡纳滨对虾初270尾,将其随机分为2组,分别以0 CFU/m L和5×107 CFU/m L剂量的致病性副溶血弧菌对凡纳滨对虾进行浸浴攻毒实验。在实验第6小时、12小时、24小时和36小时取肝胰腺,进行抗氧化酶活性及免疫相关基因表达测定。结果显示,感染副溶血弧菌后,实验组对虾肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于对照组(P0.05),而过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)活性随感染时间的增加呈现先上升后下降的趋势,CAT活性于第12小时达到最大值,而GSH-PX和GST分别在第6小时和第24小时达到最大值,此结果表明副溶血弧菌感染对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性有显著影响,对其机体免疫防御系统有明显的破坏作用。Rab蛋白基因(Rab)和干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(Grim-19)表达水平显著高于对照组(P0.05),抗菌肽crustin和酚氧化酶原基因(Pro PO)的表达水平呈现先升高后降低趋势,分别在第12小时和第24小时达到最大值,分别为11.4倍和28.2倍,而GST基因表达水平在第12~36小时显著低于对照组(P0.05)。m TOR信号通路中真核细胞始动因子4E结合蛋白(4EBP)基因的表达水产显著高于对照组(P0.05),真核细胞翻译启动因子1(e IF4E1A)和真核细胞翻译启动因子2(e IF4E2)基因的表达水平呈现先升高后降低的趋势,分别在第12小时和第6小时达到最大值,分别为2.6倍和1.6倍,核糖体S6蛋白激酶基因(P70s6k)的表达水平显著低于对照组(P0.05)。上述结果表明,凡纳滨对虾感染致病性副溶血弧菌后,肝胰腺抗氧化酶活性及免疫相关基因的表达均受到显著影响。 相似文献
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急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病,给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂,现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长,对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性,基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高,最低检测限分别为5.43×100和4.31×101 copies/μL,样品平均检测时间为26min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性,以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明,感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB;从感染2h的结果来看,pirB比pirA检出率更高。此外,致病因子pirA和pirB比toxR... 相似文献
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从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的进化地位最接近。综合上述实验结果分析得出,该细菌分离物为副溶血弧菌。 相似文献
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10株副溶血弧菌多位点序列分型新序列型 总被引：1，自引：0，他引：1
2011年浙江某规模化养殖场大面积爆发凡纳滨对虾红体病。病虾未检出白斑病毒与桃拉病毒,在肝胰脏分离得到10株副溶血弧菌,对其进行基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位点序列分型。这些菌株均为新序列型(ST)菌株,其中1株为ST413,7株为ST414,2株为ST415;ST413包含新等位基因型recA-166与tnaA-121,ST414则含有新等位基因型gyrB-219。新等位基因型与新序列型已被多位点序列分型数据库确认并收录。新序列型与已知序列型均只含有3个以下相同的等位基因。结果提示,与此次凡纳滨对虾红体病相关的副溶血弧菌分离株可能经历了较高水平的分子变异,呈现出显著的分子多样性,并非来自单一克隆。本研究代表由副溶血弧菌新序列型引起凡纳滨对虾红体病的首次报道。 相似文献
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对虾养殖体系中细菌群体感应抑制菌株的筛选及其特性初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
从对虾养殖环境及肠道内筛选能够抑制细菌群体感应的活性菌株,并探讨了影响菌株活性的环境因素及其对病原坎氏弧菌(Vibrio campbellii)毒力基因表达的影响。采用滤纸片法和高通量法对分离出的纯化菌株进行筛选,获得活性菌株。评估不同培养时间和盐度对活性菌株降解N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)信号分子能力的影响,并检测活性菌株粗提物对坎氏弧菌毒力基因tox R和tlh m RNA表达的影响。分离得到2株活性菌株DC13和RS5,经16S r RNA基因序列分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。AHLs信号分子对活性菌株生长无显著性影响(P0.05)。菌株DC13培养24 h后降解AHLs信号分子能力达到最大值,菌株RS5培养12~48 h降解AHLs信号分子能力无显著变化。盐度10~30时对菌株DC13降解AHLs信号分子能力无显著性影响,但是对菌株RS5降解AHLs信号分子能力影响显著(P0.05)。活性菌株粗提物的添加使坎氏弧菌毒力基因tox R的表达上调,而毒力基因tlh的表达下调。 相似文献