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偷死野田村病毒(CMNV)引起的病毒性偷死病(VCMD)使中国对虾养殖业遭受了严重的经济损失,为查明CMNV及其变异株的分子流行病学特征,本研究采用逆转录套式PCR (RT-nPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)和TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan RT-qPCR) 3种方法,对2016~2017年中国沿海省市CMNV及一种新型野田村病毒——行动障碍野田村病毒(MDNV)的流行、分布和变异情况进行了分析。结果显示,养殖凡纳滨对虾、中国明对虾、日本囊对虾、斑节对虾和罗氏沼虾等种类中均可检测到CMNV阳性;在河北、山东、浙江、福建、广东和海南等省市采集的患病对虾中均存在CMNV。基于RT-nPCR、RT-LAMP和TaqMan RT-qPCR的检测结果显示,2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率依次分别为11.8%和7.8%,6.7%和3.9%,17.7%和12.4%;基于上述3种方法检测结果计算得出,2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率分别为26.8%和16.3%;基于RT-LAMP的分析显示,2016年样品中MDNV的阳性检出率为9.4%。本研究表明,中国沿海省市养殖虾类中VCMD的流行和危害仍不容忽视,RNA依赖的RNA聚合酶基因不断变异导致前期基于该基因开发的CMNV检测方法可靠性下降,检出假阴性风险升高;同时,发病对虾中出现了新的野田村病毒株系且具有较高的流行率,其传播危害风险值得高度关注。 相似文献
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根据偷死野田村病毒(CMNV)的保守基因序列,设计筛选出1对特异性引物CMN279,利用已公布的凡纳滨对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)特异性引物WSS235和IHHN356,建立了一种同时检测WSSV、IHHNV和CMNV的多重PCR检测方法。收集18种病原、健康对虾组织及WSSV、IHHNV、CMNV阳性病料,开展特异性测试,该方法可以特异性扩增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段,健康对虾肌肉组织、其他18种病原均未扩增出任何片段,特异性强。应用克隆方法制备目的基因质粒,应用连续稀释质粒方法开展灵敏度测试,测定该方法检测灵敏度分别为WSSV 9.74fg、IHHNV7.65fg、CMNV 10fg;与已报道的多重PCR检测灵敏度相比较,检测灵敏度提高10倍。应用本研究建立的多重PCR检测方法与实验室标准检验方法同时进行22个样品检验,多重PCR检验方法的检验结果与实验室标准方法检验结果符合率为100%。上述实验结果表明:本研究建立的多重PCR检验方法具有特异性强、灵敏度高、检验时间短、检验结果准确度高的特点,可用于WSSV、IHHNV和CMNV三种病原的快速检测诊断。 相似文献
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一例日本囊对虾暴发性死亡的病原分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了阐明山东省潍坊市一对虾养殖场发生日本囊对虾暴发性死亡的原因,采用分子生物学检测方法,对发病对虾进行了白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、黄头病毒(yellow head virus,YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)及急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)7种病原的检测,且对发病对虾进行了常规组织病理学观察。同时采用16S r DNA细菌鉴定方法及浸泡回接感染实验对分离自发病对虾体内的可疑病原菌进行了分子鉴定及毒力测试。结果显示,发病对虾样品核酸检测呈现WSSV强阳性,IHHNV和CMNV为弱阳性,其他4种病原为阴性。组织病理学观察发现,在对虾的胃、鳃等上皮组织中存在WSSV包涵体,头部肌肉纤维出现离散。对分离编号为2901、2902、2903的3株优势可疑病原菌鉴定结果显示,3株菌分别与印度格里蒙菌、交替单胞菌及溶藻弧菌相似,相似度分别为99%、99%及100%。攻毒结果显示,3株可疑病原菌的LC50分别为9.8×107、1.1×108与2.3×108 CFU/m L,各细菌毒力均较弱,非导致对虾出现暴发性死亡的病原。研究表明,导致本次日本囊对虾暴发性死亡的病因与混合感染病原WSSV、IHHNV、CMNV有关,其中WSSV感染是造成日本囊对虾暴发性死亡的主因,研究结果可为解析当前养殖日本囊对虾疾病暴发及其成因提供参考。 相似文献
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近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。 相似文献
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聚维酮碘对凡纳滨对虾偷死综合征的防治研究 总被引：2，自引：0，他引：2
对虾偷死综合征对凡纳滨对虾养殖业造成了严重危害,但是目前还无有效的防控措施。本实验开展了聚维酮碘的体外杀菌实验、生产实验和生物安全性实验,对聚维酮碘防控凡纳滨对虾偷死综合征的作用进行了系统的评估。实验结果显示,聚维酮碘能有效杀灭常见水产致病菌如副溶血弧菌、拟态弧菌、无乳链球菌;投喂含不同浓度聚维酮碘的饲料均未对凡纳滨对虾肝胰腺造成组织损伤;拌料投喂和全塘泼洒聚维酮碘可以让偷死病的死亡量明显下降;全塘泼洒聚维酮碘后水泥养虾池浮游动物和藻类的密度会显著升高。 相似文献
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中国对虾淋巴组织培养中的病毒及病理观察 总被引：5，自引：0，他引：5
通过对中国对虾的淋巴器官和经过培养的养殖、海捕中国对虾的淋巴组织细胞进行电镜观察 ,均发现在细胞内存在一种形状为球形 ,有囊膜 ,平均直径为 136nm的病毒 ,病毒分布于细胞质内 ,或成团存在 ,似为一种虹彩病毒 ;在养殖对虾淋巴器官及培养过的组织细胞中还发现另一种病毒 ,病毒粒子为正二十面体 ,无囊膜 ,平均直径为 33nm ,分布于细胞质中 ,似为一种小RNA病毒。在体外培养淋巴组织过程中 ,病毒在细胞内没有明显增殖迹象。感染病毒的细胞呈现细胞核固缩 ,细胞质空泡化 ,线粒体内嵴模糊 ,粗面内质网水肿等一系列病理变化。对淋巴组织切片进行光镜观察 ,发现淋巴器官组织部分坏死 ,有些细胞核肿大 ,苏木精深染 ,严重的细胞核结构已经被破坏。 相似文献
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本研究通过对一对虾养殖场定期采样,采用分子生物学鉴定方法,分别对对虾体内及水环境中弧菌(Vibrio sp.)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及主要病毒性病原进行了跟踪检测,同时,检测了水环境中的氨氮及亚硝基氮含量的变化趋势。结果显示,该对虾养殖场中存在的主要病原为多种致病弧菌和EHP,未检测出对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)及传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV);该养殖场中弧菌检出种类达到16种,其中,主要的弧菌种类有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌 (V. alginolyticus)、欧文氏弧菌(V. owensii)、创伤弧菌(V. vulnificus)、哈维氏弧菌(V. harveyi),且存在导致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VPAHPND);养殖中期大棚养殖池水体氨氮及亚硝氮浓度分别达到(3.5±2.0)、(8.2±0.7) mg/L,显著高于室外养殖池水体氨氮及亚硝基氮浓度(P<0.05)。养殖期跟踪的7个虾池中,出现严重对虾病害的大棚养殖池比例达到100%,而室外养殖池仅出现轻度对虾病害,发病池比例为25%。根据研究结果推测,造成大棚养殖池对虾发病死亡的主要原因为养殖对虾感染弧菌及虾肝肠胞虫,同时,养殖密度大、水体氨氮及亚硝基氮浓度过高等在对虾病害发生中起到了协同作用。本研究结果可为当前对虾养殖病害防控技术提供理论支持和科学依据。 相似文献
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本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。 相似文献
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三种对虾病毒在浙江省凡纳滨对虾中的流行性调查研究 总被引：2，自引：0，他引：2
对虾白斑综合症病毒、桃拉综合症病毒及传染性皮下与造血组织坏死病病毒是目前威胁对虾养殖业较为严重的3种病毒.分别从浙江省6个凡纳滨对虾的主养殖区随机采样对虾699尾,通过PCR检测对虾的病毒携带情况.检测结果显示,6个养殖地区传染性皮下造血组织坏死病病毒检测结果均呈阳性,总阳性率达100％;萧山、舟山、象山养殖场的对虾白斑综合症病毒检测结果有阳性,总阳性率为5.58％;6个养殖场均未检测出桃拉综合症病毒.表明浙江省凡纳滨对虾养殖区域的桃拉综合症病毒得到了有效控制,传染性皮下造血组织坏死病病毒和对虾白班综合症病毒有较高的感染率,而且存在混合感染的情况. 相似文献
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急性病毒性鲫鳃出血病的病理变化 总被引：3，自引：0，他引：3
病毒性鲫(Carassius auratus)鳃出血病的突发流行可导致鱼高致死率,使中国部分养鱼场近些年受到重创。为了充分认识这种鱼病的发生发展过程,我们结合PCR、光学显微镜和透射电镜,对病鱼头肾等组织的病变及病毒分布情况进行了分析。注射自然发病鱼的组织滤液(病毒悬液),能使正常鲫感染,且出现与自然发病鲫相同的症状及高致死率;病原有典型疱疹病毒的形态特征(故称为鲫疱疹病毒,Ca HV)。经PCR扩增对已知鲤科疱疹病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因进行检测,可确定Ca HV存在于被感染鱼的肝、脾、肾和头肾组织中。对组织病理变化及不同时序进行比较,结果表明Ca HV感染会引起鲫这些组织不同程度病变,而鳃和头肾的病理变化有显著时序相关性。在头肾细胞中还观察到大量Ca HV颗粒,预示鲫头肾是Ca HV侵染和复制的主要靶器官。 相似文献
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Abstract Snapper, Pagrus auratus (Forester), is an important recreational species in marine waters of Victoria, Australia. This study estimated survival for compulsorily released undersized P. auratus by holding fish in cages and tanks for 3 days. In all, 620 P. auratus caught by angling were assessed for post-release survival and 200 additional fish were used as controls. The survival rate was greater for shallow-hooked (97%) than deep-hooked (48%) P. auratus . Post-mortems showed that hooking injuries to the throat and/or gill area caused most deaths, while piercing of the heart also caused mortalities. Removing deeply ingested hooks decreased survival. To estimate survival of P. auratus across the Victorian fishery, this study's results should be combined with estimates of shallow-hooking rates in the fishery. Shallow-hooking rate estimates would quantify the impact of the low survival rate found for deep-hooked fish. 相似文献
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Mass mortalities of hatchery-reared juvenile groupers have occurred in southern Taiwan. The diseased fish swam in a darting, corkscrew fashion. Light microscopy revealed vacuolation in the brain tissue. Electron microscopy showed numerous non-enveloped, cytoplasmic viral particles (20–25 nm in diameter) in the brain cells, and many virions were enclosed in the membrane-bound organelles of the cells. Two structural proteins of the purified grouper virus, with molecular weights of 44 and 43 kDa, were revealed by SDS-PAGE. Moreover, the results of RT-PCR and nested PCR diagnosis using primers specific to the T2 and T4 target segments of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) RNA2 genes suggest that this virus is a fish nodavirus, and is designated as GNNV 9410 strain (grouper nervous necrosis virus strain 9410). This is the first case report of viral nervous necrosis among marine fish in Taiwan. 相似文献
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神经坏死病毒(Nervous necrosis virus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原.发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染.2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E. malabaricus)、青石斑鱼(E. awoara)、赤点石斑鱼(E. akaara)和云纹石斑鱼(E. moara)中检出5个神经坏死病毒分离株.检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%.对这些病毒的RT-PCR产物421 bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%.将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelus spp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上.对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒.结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原.RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法. 相似文献
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采用同源克隆、生物信息学方法及荧光定量PCR(Real-time PCR)对缩骨鲫(Carassius auratus sogu var.)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行克隆,分析和组织表达状况研究。结果显示:缩骨鲫基因组MSTN基因全长4 737 bp,含有两个内含子和三个外显子;编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸,包括信号肽(1aa~23aa),TGF-β前肽保守区域(34aa~256aa),TGF-β功能区(281aa~375aa),保守的RXXR蛋白酶酶切位点以及C-端活性区域9个保守的半胱氨酸残基,这与其他物种MSTN相似。此外,缩骨鲫与鲫鱼(Carassius auratus)的MSTN氨基酸序列同源性最高,达到96.1%。以β-actin为内参基因,荧光定量PCR分析表明,MSTN在肌肉中表达量最高;脑、眼、心脏中次之;在肝胰脏、卵巢、肠和肾脏中微量表达。 相似文献
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N Vendramin A Toffan M Mancin E Cappellozza V Panzarin G Bovo G Cattoli I Capua C Terregino 《Journal of fish diseases》2014,37(4):371-383
Viral encephalopathy and retinopathy (VER), otherwise known as viral nervous necrosis (VNN), is a severe pathological condition caused by RNA viruses belonging to the Nodaviridae family, genus Betanodavirus. The disease, described in more than 50 fish species worldwide, is considered as the most serious viral threat affecting marine farmed species in the Mediterranean region, thus representing one of the bottlenecks for further development of the aquaculture industry. To date, four different genotypes have been identified, namely red‐spotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV), striped jack nervous necrosis virus (SJNNV), tiger puffer nervous necrosis virus and barfin flounder nervous necrosis virus, with the RGNNV genotype appearing as the most widespread in the Mediterranean region, although SJNNV‐type strains and reassortant viruses have also been reported. The existence of these genetically different strains could be the reason for the differences in mortality observed in the field. However, very little experimental data are available on the pathogenicity of these viruses in farmed fish. Therefore, in this study, the pathogenicity of 10 isolates has been assessed with an in vivo trial. The investigation was conducted using the European sea bass, the first target fish species for the disease in the Mediterranean basin. Naive fish were challenged by immersion and clinical signs and mortality were recorded for 68 days; furthermore, samples collected at selected time points were analysed to evaluate the development of the infection. Finally, survivors were weighed to estimate the growth reduction. The statistically supported results obtained in this study demonstrated different pathogenicity patterns, underlined the potential risk represented by different strains in the transmission of the infection to highly susceptible species and highlighted the indirect damage caused by a clinical outbreak of VER/VNN. 相似文献
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Young Chul Kim Woo Ju Kwon Joon Gyu Min Kwang Il Kim Hyun Do Jeong 《Journal of fish diseases》2019,42(4):519-531
We determined the complete genomic RNA sequence of a new type of betanodavirus Korea shellfish nervous necrosis virus (KSNNV) isolated from shellfish. Compared with other isolates representing four genotypes of betanodaviruses, the identity of the whole nucleotide sequence of the virus was in the range of 76%–83% with the presence of specific genetic motifs and formed a separate new branch in the phylogenetic analysis. In pathogenic analysis by immersion method, KSNNV‐KOR1 shows 100% cumulative mortality like SFRG10/2012BGGa1 (RGNNV) in newly hatched sevenband grouper and mandarin fish, which is clearly different from those found in negative control groups. There were no significant differences in increasing rates of mortality and viral intra‐tissue concentration of larval fishes infected with KSNNV‐KOR1 at both 20 and 25°C water temperature. Histopathological examination of each fish species in the moribund stage revealed the presence of clear vacuoles in both brain and retinal tissues similar to typical histopathology features of RGNNV. In the present study, we first report a new betanodavirus from shellfish as the aetiological agent of viral nervous necrosis disease in fish with complete genomic nucleotide sequence and pathogenic analysis. 相似文献
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采用常规石蜡切片、苏木精-伊红染色的方法,研究了鲫（ Carassius auratus auratus ）自然感染圆形碘泡虫（Myxobolus rotundus）后的组织病理变化。结果表明,感染圆形碘泡虫后,在鲫的头部、鳃和体表能形成大小不一的圆形或椭圆形乳白色孢囊,其孢囊为典型的3层结构：外层的结缔组织、双层质膜的外质以及各个发育阶段的孢子或营养体组成的内质。病理切片可见鱼体各组织器官均有不同程度的病变,主要表现为鳃丝粘连、肿胀增生;肝脏发生以肝血窦为中心的透明、空泡变性;肾小管内皮脱落,肾小球萎缩;肠道粘膜层脱落,肌层细胞肿胀病变;脾脏的含铁血黄素增多等异常现象。 相似文献