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《畜牧兽医学报》2016,(4)
旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。 相似文献
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通过敲除猪的ApoE基因,为后期构建ApoE缺陷型动物模型奠定基础。利用CRISPR/Cas9系统和实验室前期构建的报告载体,分别构建了靶向猪ApoE基因的两个CRISPR/Cas9表达载体和相应的报告载体。通过CRISPR/Cas9表达载体和RG(Red-GFP)报告载体转染HEK 293T细胞荧光观察结果显示,构建的CRISPR/Cas9表达载体均有较高的活性,进一步在流式细胞仪上检测其活性分别为6.50%和6.83%。将CRISPR/Cas9表达载体和RPG(Red-PuroR-GFP)报告载体转染PK15细胞系,经过嘌呤霉素药物筛选后,对富集到的细胞进行基因组检测。结果显示本系统能够对猪PK15细胞中的ApoE基因进行有效的敲除,其敲除效率分别为40%、53.3%。试验结果可为ApoE敲除猪动物模型的构建提供理论依据。 相似文献
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《河南畜牧兽医(综合版)》2014,(11):8-8
中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员、吉林大学教授赖良学博士的研究团队针对猪的酪氨酸酶、PARK2和PINK1基因的外显子设计了Cas9打靶质粒，将其分别转染版纳小型猪的胎儿成纤维细胞和巴马小型猪的胎儿成纤维细胞后，获得了纯合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2和PINK1双基因敲除的细胞系。细胞系用于体细胞核移植后获得15头酪氨酸酶基因敲除克隆猪，20头PARK2和PINK1双基因敲除克隆猪。 相似文献
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功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步,基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。基因敲除手段种类繁多,其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术,具有高效、便捷、精确等优点,在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。随着科研工作的逐渐深入,CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用,为科研工作的开展提供参考。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(4)
CRISPR/Cas9系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的免疫机制。近年来,已发展为一种快捷高效的基因编辑工具,用于研究编码或非编码RNA的功能。非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA,其可通过多种调控途径在动物的生长发育、疾病免疫等生理或病理过程中发挥重要的生物学功能。CRISPR/Cas9技术可以靶向核酸序列稳定敲除基因,得到敲除小鼠或细胞系,虽然其在非编码RNA功能研究中的使用干扰了邻近基因或宿主基因表达,但该技术的出现为非编码RNA功能机制的探索提供了不同的途径。本文通过简要概述CRISPR/Cas系统的发展和作用原理,并重点介绍CRISPR/Cas9技术在动物miRNA、lncRNA及circRNA功能研究中的应用,以期为相关研究提供参考。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的免疫机制。近年来,已发展为一种快捷高效的基因编辑工具,用于研究编码或非编码RNA的功能。非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA,其可通过多种调控途径在动物的生长发育、疾病免疫等生理或病理过程中发挥重要的生物学功能。CRISPR/Cas9技术可以靶向核酸序列稳定敲除基因,得到敲除小鼠或细胞系,虽然其在非编码RNA功能研究中的使用干扰了邻近基因或宿主基因表达,但该技术的出现为非编码RNA功能机制的探索提供了不同的途径。本文通过简要概述CRISPR/Cas系统的发展和作用原理,并重点介绍CRISPR/Cas9技术在动物miRNA、lncRNA及circRNA功能研究中的应用,以期为相关研究提供参考。 相似文献
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我国科学家首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究,成功敲除了猪内源性PPARγ基因。近日,从中科院广州生物医药与健康研究院获悉,该院研究员赖良学研究团队与美国密歇根大学心血管研究中心陈育庆团队合作,首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究,成功敲除了猪内源性PPARγ基因。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2015,(17)
CRISPR/Cas9系统作为第3代人工核酸内切酶,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节肌肉的生长,影响动物的产肉量。为了获得MSTN基因敲除的细胞株,给转基因动物的制备提供材料,试验利用CRISPR/Cas9系统的不同类型的表达载体对牛MSTN基因外显子序列随机设计靶位点,利用T7核酸内切酶I(T7EI)从中挑选出敲除效率最高的靶位点的表达载体,在无筛选标记条件下对牛胎儿成纤维细胞进行基因敲除。结果表明:经过长时间培养获得了基因敲除的细胞株。说明CRISPR/Cas9技术用于基因敲除方面的研究应用前景广阔。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(3)
本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT~-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT~-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT~-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT~-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。 相似文献
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基因编辑是利用核酸酶在基因组的特定位点产生DNA双链断裂，从而触发细胞自身的DNA损伤修复机制，实现对靶基因序列进行位点特异性修饰。规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）及其相关蛋白9（Cas9）系统作为第3代基因编辑技术在农业和基因治疗研究中发挥着重要作用，与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比，它可以靶向基因的任何位点引起DNA双链断裂，实现目标基因的精准敲除或插入外源片段，并能快速、高效地修饰基因组，包括基因敲除、敲入、抑制、激活等，是应用最广泛的基因编辑工具。CRISPR/Cas9技术的出现彻底改变了生命科学、医学和遗传学研究现状。近年来，利用CRISPR/Cas9技术对动物基因组进行修饰，开启了畜禽分子育种的新纪元，不仅极大地推动了现代畜禽养殖技术的发展，而且为人类医学研究做出了特殊贡献，特别是在猪和鸡上。作者以猪和鸡为对象，综述了CRISPR/Cas9技术在异体器官移植供体、人类疾病的生物模型、抗病育种材料、全基因组高通量筛选等方面的研究进展，以及如何利用CRISPR技术快速又简单地生产出基因编辑猪、鸡，为推动CRISPR技术制备其他基因编辑动物提供参考依据。 相似文献
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本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）K88的热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin，LT）基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列，并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段；将供体片段转化至ETEC K88，同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统，对LT基因进行敲除；通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株，并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示，λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段，CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除，最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明，K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失，并且生长速度比野生型菌株减缓，LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。 相似文献
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旨在通过CRISPR/Cas9技术研究Gata4基因在雄性小鼠睾丸中的作用机制。试验以C57BL/6小鼠为模型,通过CRISPR/Cas9技术在雄性小鼠体内敲除Gata4基因,组织学观察睾丸形态学变化,ELISA法测定雄激素相关合成酶,实时定量PCR检测相关标记基因。利用CRISPR/Cas9技术成功在小鼠体内敲除Gata4基因,通过PCR扩增、酶切计算得到基因敲除率93%;在2月龄小鼠性成熟时,通过定量PCR、HE染色和ELISA检测发现,与对照组相比,敲除组小鼠睾丸发育迟缓,明显变小,精原细胞和精子生成减少,睾丸中雄性信号通路相关基因(Stra8,Vasa,Dazl,Tnp1,Spo11,Sox9,17HSDb3,Dmrt1)表达量降低,雄激素水平显著降低。研究表明,Gata4在雄性小鼠生殖器官发育与精子生成过程中具有重要功能。 相似文献
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为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0%,并在鸡DF-1细胞基因组上实现了AMHR2基因的精确编辑。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统是一种新型RNA靶向的基因编辑系统。在近几年的研究中, CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展十分迅猛, 因其具有经济、高效、简便的特点而广泛应用于育种、医疗、工业等领域。介绍了2种新型基因编辑技术, 阐述了CRISPR/Cas9的结构、功能以及CRISPR/Cas9基因编辑技术原理, 综述了该技术在牧草中的应用研究进展, 以期为利用CRISPR/Cas9系统研究牧草基因功能及改良牧草性状提供思路。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(9):1720-1725
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可以感染几乎所有温血动物的专性细胞内寄生原虫。该寄生虫入侵和感染宿主细胞需要其分泌细胞器所分泌的蛋白,其中包括微线体蛋白。近年来,CRISPR/Cas9技术已经成为分子生物学和功能基因组学研究的重要工具,本研究利用CRISPR/Cas9技术对弓形虫Ⅰ型虫株RH和Ⅱ型虫株PRU的微线体蛋白mic3基因进行敲除。通过单克隆的筛选和鉴定,成功获得了2种虫株的mic3敲除株。之后对RH敲除株进行研究,发现mic3缺失可以轻微提高虫体在体外培养时的生长速度以及对小鼠的毒力。本研究不仅说明了CRISPR/Cas9技术可以应用到弓形虫的基因敲除和改造上,并且不受弓形虫虫株的限制,同时也为进一步研究mic3在虫体中的功能奠定基础。 相似文献