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1.
己糖激酶(hexokinase,HXK)是糖酵解途径的限速酶,在能量代谢中充当极其重要的角色。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)具有完整的糖酵解途径,其基因组中有2个序列相似度较高的己糖激酶编码基因拷贝(NBO_1320g0001,NBO_27g0008)。根据其中的一个基因拷贝(NBO_27g0008)序列设计特异性引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板成功克隆了该基因,命名为Nb HXK-1。该基因大小为894 bp,包含完整的ORF,编码297个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为34.241 k D,等电点(p I)为5.26,蛋白质的氨基酸序列有31个磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点,无跨膜结构域,有信号肽,二级结构主要由α螺旋(54.55%)、延伸片段(17.80%)和无规则卷曲(27.61%)组成。系统进化分析显示Nb HXK-1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)己糖激酶(Nc HXK)氨基酸序列的亲缘关系较近。将Nb HXK-1基因插入原核表达载体p ET-28a(+)并转化BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达后经蛋白质串联质谱鉴定和Western blot分析显示,获得了与预期大小一致的约35 k D的重组Nb HXK-1蛋白,为进一步阐明Nb HXK-1的生物学功能奠定了基础。 相似文献
2.
海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4),除了Nb Tre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区。基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了Nb Tre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 k D,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点。通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得Nb Tre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合Nb Tre1蛋白,其分子质量与预期值一致。融合Nb Tre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600。通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。 相似文献
3.
《蚕业科学》2017,(1)
选择家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白质谱数据库中新发现的假定表面蛋白NBO_33g0013进行研究,了解该蛋白质的功能及是否参与微孢子虫对宿主细胞的侵染过程。预测该蛋白质分子质量为26.1 k D,等电点为4.59,其序列N端具有信号肽,无跨膜螺旋结构,含3个N-糖基化位点,无O-糖基化位点,不具有典型的功能结构域,与柑橘凤蝶微孢子虫(Papilio xuthus)的一个假定蛋白序列相似度达到93%。以家蚕微孢子虫CQ1分离株的基因组DNA为模板克隆该蛋白质的编码基因,构建重组表达载体进行该蛋白质的原核表达,并制备获得多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析确证该蛋白质定位在家蚕微孢子虫孢子表面。经体外细胞感染实验初步分析,尚未发现该蛋白质参与了微孢子虫孢子对宿主Bm E细胞的粘附过程,推测该蛋白质可能为家蚕微孢子虫孢壁的结构组成型蛋白质,在孢壁的构架形成中发挥作用。 相似文献
4.
海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的开放阅读框长1 386 bp,为单外显子结构,编码461个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量53.7 k D,等电点5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1个糖基转移酶结构域和4个潜在的N-糖基化位点,亚细胞定位预测该蛋白质位于细胞质中。多重序列比对分析结果表明,Nb TPS1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分别为59.0%、54.7%,系统发育进化树显示三者的亲缘关系与之相符。构建重组表达载体Nbtps1/p ET-28a(+)并转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及亲和纯化后获得最终质量浓度为1.18 mg/m L的重组融合蛋白His-Nb TPS1。用纯化后的融合蛋白制备兔多克隆抗体Anti-Nb TPS1,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600,并通过Western blotting检测验证了该多克隆抗体的特异性,为研究Nb TPS1的生物学功能以及家蚕微孢子虫的间接免疫检测奠定了实验基础。 相似文献
5.
层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的黏附等方面都有重要作用。通过检索微孢子虫数据库发现家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)存在假定层粘连蛋白基因Nb HLAMB4,根据该基因序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了Nb HLAMB4基因。该基因的开放阅读框(ORF)全长为1 104 bp,预测编码的蛋白质含有367个氨基酸,分子质量为43.74 k D,等电点为5.72。Nb HLAMB4蛋白序列含有一个N-糖基化位点和Pfam:SAS-6_N结构域,无信号肽,也无跨膜结构域。应用酵母双杂交技术,以Nb HLAMB4作为诱饵蛋白,通过筛选家蚕中肠c DNA文库,初步得到3个与Nb HLAMB4互作的候选蛋白质,分别是家蚕热休克蛋白(Hsp40)、锌指蛋白420类似物(similar to zinc finger protein 420)、氨肽酶N(aminopeptidase N)。研究结果为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制提供了新的线索。 相似文献
6.
SUMO(small ubiquitin-like modifier)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme)是SUMO修饰靶蛋白过程中唯一的E2结合酶,在SUMO修饰过程中发挥关键作用。本研究克隆了家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)NbUbc9基因的完整开放阅读框。序列分析表明,NbUbc9与所有来源于微孢子虫属(Nosema)的Ubc9聚类在同一大分支上,与同为Nosema属的西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)Ubc9同源性最高,说明NbUbc9蛋白在进化上高度保守。qRT-PCR分析表明,家蚕内源性Ubc9的表达量在Nb感染后有所下降,而Nb自身NbUbc9的表达显著增加。对NbUbc9基因RNAi后,Nb基因组DNA的复制水平显著下降,说明NbUbc9在Nb的细胞增殖中起着关键作用。经Pull-down和质谱分析,初步鉴定出有46个家蚕蛋白和8个Nb蛋白可能与NbUbc9相互作用,涉及蛋白质折叠与转运、去泛素化、信号转导等。研究结果为进一步研... 相似文献
7.
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)是戊糖磷酸途径的限速酶,参与生物体内递氢体NADPH的产生。通过检索微孢子虫数据库获得家蚕微孢子虫6PGDH基因序列,以家蚕微孢子虫镇江株基因组为模板,设计特异性引物成功克隆了该基因,命名为Nb6PGDH,并对该基因进行序列特征和表达特征分析,为了解6PGDH基因在微孢子虫生长发育过程中的功能提供有用信息。克隆得到的序列全长1 374 bp,包含一个完整的ORF,编码457个氨基酸;与Gen Bank数据库中家蚕微孢子虫6PGDH基因长度相同,相似度为99. 42%,其中8个碱基存在差异,编码的3个氨基酸发生改变。生物信息学分析表明Nb6PGDH蛋白没有信号肽,无跨膜结构域,分子质量为51. 8 k D,等电点5. 83,存在38个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR分析结果表明,家蚕微孢子虫感染家蚕后2~168 h,中肠组织中Nb6PGDH基因都有所表达,且表达水平在生长发育过程中发生变化,说明Nb6PGDH基因在家蚕微孢子虫增殖发育过程中具有一定的生理功能。 相似文献
8.
水通道蛋白(aquaporin,AQP)是在动物、植物、微生物细胞膜上发现的能够高选择性透过水分的一类通道蛋白。通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的AQP基因,并分析其表达特征,为研究AQP在Nb孢子侵染宿主细胞时调节孢子内渗透压的作用积累基础信息。依据从Microsporidia DB和MIPModDB数据库比对获得的序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了NbAQP基因,该基因大小为750 bp,编码蛋白质分子质量为26.66 k D,具有MIP超家族水通道蛋白的保守跨膜结构域。用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法,在Nb孢子感染宿主家蚕的7 d内,家蚕中肠组织中都能检测到NbAQP基因的表达,自感染后2 d开始,NbAQP基因的表达水平开始明显上升,直至感染后7 d达到最高水平。NbAQP基因的高水平表达时相与家蚕添食Nb孢子后中肠组织中成熟Nb孢子大量出现的时间相一致,初步推测NbAQP可能在家蚕微孢子虫成熟孢子发芽时的孢子内渗透压调节中起到重要作用。 相似文献
9.
《蚕业科学》2015,(1)
Dicer是一种具有RNaseⅢ酶活性的蛋白质,参与RNAi起始阶段siRNA和miRNA的形成,为RNA诱导沉默复合物(RISC)形成的关键因子之一,在基因的转录后调控中扮演重要角色。采用生物信息学方法从家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)全基因组数据中鉴定到一个Dicer相似蛋白(Dicer-like)基因,命名为Nb DCL(Gen Bank登录号:EOB15391)。预测Nb DCL的二级结构中含有RNaseⅢ结构域和dsRNA结合结构域。基于Dicer-like基因的系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的亲缘关系最近,并与真菌形成姊妹枝,说明微孢子虫Dicer-like与真菌的同源基因来自共同的祖先。基因组共线性分析显示,Dicer-like基因及其两侧基因在微孢子虫基因组中的排列顺序具有显著的保守性,但兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)和比氏肠道微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)基因组中的Dicer-like基因在物种分化过程中发生了丢失。对Dicer-like基因和Agronaute相似蛋白基因、转座子的共存分析表明,家蚕微孢子虫等Nosema属微孢子虫均保留了古老的RNAi作用机制。RT-PCR检测被家蚕微孢子虫感染48~240 h的家蚕幼虫中肠中Nb DCL基因均有转录。研究结果为进一步探究家蚕微孢子虫RNAi的调控机制提供了有益线索。 相似文献
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家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。 相似文献
11.
《蚕业科学》2015,(4)
建立灵敏、特异、稳定的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)表面蛋白分离鉴定技术,对研究其侵染机制和早期检测技术非常重要。采用生物素Sulfo-NHS-SS-biotin能特异性标记柞蚕微孢子虫的表面蛋白;经生物素标记后的微孢子虫用0.01 mol/L NaOH和2%SDS的混合液裂解结合超声波破碎的方法能提取到更多的微孢子虫总蛋白质;用30%乙腈和70%甲酸配合沸水浴处理可有效洗脱微孢子虫表面蛋白。对得到的柞蚕微孢子虫表面蛋白检测样品进行LC-MS/MS质谱鉴定,共获得了8个假定的表面蛋白,其中分子质量为26.6 k D(Np SWP12)、25.7 k D(Np SWP26)、32.0 kD(Np SWP30)的3个假定蛋白经间接免疫荧光分析确证为定位在孢子表面的蛋白质。序列分析显示,NpSWP12、NpSWP26、NpSWP30与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白NbSWP12、NbSWP26、NbSWP30的氨基酸序列相似度分别为100%、93%、79%,其中Np SWP26无N-糖基化位点和O-糖基化位点,但C端具有介导孢子粘附宿主细胞的肝素结合基序。分离鉴定的3个表面蛋白可以作为柞蚕微孢子虫侵染机制研究和早期检测的靶标蛋白。 相似文献
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为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。 相似文献
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重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析 总被引：1，自引：1，他引：0
用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。 相似文献
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细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。 相似文献
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家蚕微孢子虫保存株DNA的特异性扩增 总被引：1，自引：0，他引：1
尝试研制成了一种微孢子虫检测的新系统。以家要微孢子虫小亚单位rRNA基因的推导假基因及保守序列为引物,对家蚕微孢子虫(Nosemabombycis.Nb)保存株的DNA进行了特异的PCR扩增。检测了六株微孢子虫:三株为家蚕微孢子虫株系,即保存株SES—NU、NIS—001和分离自草地贪夜蛾(Spodoptera depravata)的株系Sd—NU—IW8401;及三个种:Nosema Sp.株NIS—Mll,变形孢子虫属的分离株Vainmorpha Sp.NIS—M12和具褶孢子虫属分离株Pleistoophora Sp.PI—NU,以此六株微孢子虫的DNA为模板进行PCR扩增,仅家蚕微孢子虫(Nb)的保存株SES—NU、NIS—001获得扩增产物。 相似文献
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基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。 相似文献
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为了获取家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)与宿主家蚕之间互作的新线索,利用定量蛋白质组学同位素标记相对定量和绝对定量(i TRAQ)技术分析感染与未感染Nb的家蚕5龄末幼虫精巢组织的蛋白质组表达变化,在置信度≥95%的1 326个蛋白质中,共发现78个蛋白质的表达量发生了变化,其中63个蛋白质表达上调,15个蛋白质表达下调。GO注释差异表达蛋白质参与了14个生物学过程,以参与代谢过程和细胞内过程的蛋白质占比较高;参与的细胞组分有9个,以胞外结构域占比较高;参与的分子功能有4个,以催化活性及蛋白质结合的占比较高。KEGG通路分析差异表达蛋白质共参与57个信号转导通路,主要包括代谢通路,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢通路以及溶酶体途径。利用qRT-PCR测定随机选取的8个差异表达蛋白质的编码基因mRNA转录水平变化,结果有5个基因mRNA的转录变化与i TRAQ检测蛋白质的表达变化趋势一致,而另外3个基因mRNA转录变化与蛋白质的表达变化不一致。研究结果显示差异蛋白质与能量代谢、氨基酸转运、发育调节、免疫调控等多个生物学过程有关,提示Nb与宿主家蚕之间存在复杂的相互作用关系。 相似文献
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家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析 总被引：2，自引：1，他引：1
设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。 相似文献
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以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上 相似文献