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以插入重组Taq DNA聚合酶基因的pET-24a表达质粒转化大肠杆菌菌株,转化菌铺平板的最佳量为50至100 μL,可获得转化菌的单菌落,单菌落扩大到200 mL培养量,表达Taq DNA聚合酶,经SDS-PAGE分析,表达带的相对分子质量约为82 ku,最佳表达条件为接种量1/500,工程菌培养到OD600值为1.0开始诱导,以2 mmol/L IPTG诱导8 h,Taq DNA聚合酶可获得较高的表达效率. 相似文献
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《中南林业科技大学学报(自然科学版)》2019,(8)
以云南金花茶为试验材料,利用试剂盒法、SDS法及CTAB法3种方法提取其DNA,并对3种方法的提取结果进行比较;经初筛合成云南金花茶EST-SSR引物,并对影响SSR-PCR体系的Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物及模板DNA这5个因素进行L_(16)(45~)正交实验,以期建立较为稳定的云南金花茶SSR-PCR体系。试验结果表明:试剂盒法提取得到的云南金花茶DNA质量最好且符合SSR分子标记试验。各因素对PCR扩增效果的影响程度为:Mg2+引物 Taq DNA聚合酶 dNTP模板DNA。试验最终确定的金花茶SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为:2.0μL Taq Buffer、1.5μL Mg2+(25 mmol/L)、0.3μL dNTP(10 mmol/L)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、前后引物各0.4μL(10μmol/L)、0.5μL模板DNA(50 ng/μL)、14.7μL ddH_2O。建立和优化云南金花茶SSR反应体系,可为云南金花茶不同种群的遗传变异研究提供基础。 相似文献
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采用正交设计L9(34)对影响湿地松、加勒比松SRAP反应体系的DNA浓度、dNTPs浓度、引物用量、Taq DNA聚合酶浓度4个因素进行了优化试验,结果表明:扩增反应体系5优于其他体系,即25μL体系中含有DNA 40 ng、dNTPs 1mmol/L、引物10 μmol/L、DNA聚合酶1.0U.在此基础上,通过单... 相似文献
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以舟山群岛的普陀樟（Cinnamomum japonicum var.chenii）新鲜叶片为实验材料,采用L16（45）正交试验设计,对影响普陀樟SRAP-PCR反应的Mg2+浓度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素组合进行了筛选。结果表明：适于普陀樟的SRAP-PCR反应体系（20μL）为2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4μmol/L引物、10 ng模板DNA、2μL 10×PCR buffer,该体系位点清晰,扩增稳定;利用该反应体系从100对SRAP引物组合中筛选出多态性好的引物24对。 相似文献
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采用L16(4^5)正交试验设计,对影响兴安落叶松SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、d NTPs、Mg^2+、Taq聚合酶浓度及引物浓度)进行了试验分析,其结果表明:兴安落叶松SSR-PCR体积为20μL的最佳反应体系是模板DNA用量50 ng、正反向引物浓度均为5μmol·L^-1、d NTPs浓度为2.5 mmol·L^-1、Mg^2+的浓度为2.5 mmol·L^-1、Taq聚合酶用量为1.0 U、最佳退火温度为60℃。试验所建立的反应体系可进一步用于兴安落叶松SSR遗传图谱构建、多样性分析、良种选育等方面的研究中。 相似文献
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仙茅根茎DNA的提取及其ISSR-PCR反应体系的优化 总被引：2，自引：0，他引：2
为了改进仙茅基因组DNA的提取方法,从而为其遗传多样性研究提供参考依据,以仙茅根茎为材料,采用CTAB法探讨了仙茅根茎DNA大量提取中CTAB浓度、PVP用量及Na Cl浓度对其DNA质量的影响情况。结果表明,仙茅根茎DNA的大量提取方法的最优组合为:CTAB的浓度为2%,PVP的加入量为0.20 g,Na Cl的浓度为4 mol/L。为了得到仙茅的最佳ISSR-PCR反应体系,以(CT)8 RG为引物,采用单因素实验与正交实验相结合的方法,得到的最优反应体系(25μL)为:1×PCR Buffer,模板DNA浓度为50 ng,Mg2+浓度为2.50 mmol/L,d NTPs浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.40μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为1.50 U。 相似文献
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利用正交试验L16(45),结合单因素试验对厚朴相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记反应体系的5个因素(Mg2+,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA)进行优化试验,结果表明:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:dNTPsTaq酶模板DNAMg2+引物;筛选出各反应因素的最佳水平,建立厚朴SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.5 U,Mg2+1.8 mmol.L-1,模板DNA100 ng,dNTP 0.24 mmol.L-1,引物0.40μL。试验表明,该体系重复性好、稳定性强。 相似文献
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杉木rDNA ITS-1区的克隆及序列测定 总被引：5，自引：0，他引：5
编码核糖体ＲＮＡ的基因是由一些高度重复序列组成的多基因家族。ｒＲＮＡ基因以串联重复形式存在于染色体上,每个细胞中的拷贝数目在１０００～１０,０００之间,由于ｒＲＮＡ基因中包含了进化速度不等的编码区、非编码转录区和非转录区,因而可以选择其中保守程度不同的片段作分子标记研究植物的系统发育及遗传变异。ＩＴＳ是核糖体ＤＮＡ中介于１８ｓ和５－８ｓ之间（ＩＴＳ－１）以及５－８ｓ和２６ｓ（ＩＴＳ－２）之间的转录间隔区,目前已研究过的被子植物ＩＴＳ－１一般小于７００ｂｐ（ＡｌｖａｒｅｚＢｕｌｙｌｌａｅｔａｌ．… 相似文献
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以水稻品种日本晴DNA为模板,用PCR的方法从水稻胚特异性表达基因OsESG上游序列扩增出特异性条带,克隆出种子胚特异性启动子,长度为1.1kb,且已知的功能部位序列没有发生改变。用它构建了带动报告基因GUS表达的双元载体,并用农杆菌介导法转化水稻得到了转基因植株。对GUS基因的表达检测表明,由该启动子序列引导的GUS基因仅在胚中特异性表达,而其它组织中都未表达,证实该启动子具有胚特异性表达的功能。 相似文献
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Genetic transformation of loblolly pine using mature zygotic embryo explants by Agrobacterium tumefaciens 总被引：1，自引：0，他引：1
Introduction1Genetictransformationinconifershasthepotentialtoallowtheselectiveimprovementofindividualtraitsinelitecloneswhilestillmaintainingtheexistingcombinationofgenesresponsibleforthesuperiorphenotype(Charestetal.1991;Jamesetal.1996;Walteretal.1999).Atpresent,althoughconsiderableresearchefforthasbeendevotedtothegeneticengineeringofconiferspecies(Sederoffetal.1986;Bekkauoietal.1988,1990;Robertsonetal.1992;Bomminenietal.1993;Shinetal.1994;Klimaszewskaetal.1997),ithaslaggedbehindadvancesma… 相似文献
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利用简并引物RT—PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX—AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101（含辅助质粒pJICSa—rep）侵染烟草。40d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明：从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。 相似文献
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采用含有激素合成相关基因的根癌农杆菌，伤口接种已感染植原体的泡桐丛植组培苗和健康组培苗，结果发现对丛植苗的致瘤能力明显低于健康对照苗，且被接种病苗的丛枝症状缓解，从健苗获得的T-DNA转化泡桐瘤组织细胞能在无激素培养基上稳定生长和连续继代培养2年以上，说明瘤组织细胞自身已获得了细胞分裂素和生长素合成能力，根据已报道的根癌农杆菌株系pTil5955T-DNA的异戊烯基转移酶基因（ipt)的保守序列，设计了一对引物（CYT和CYT′），用多聚酶链式反应（PCR）扩增了我国杨树致瘤农杆菌ipt基因部分序列（427bp片段），也从遗传转化的两个泡桐无性系瘤组织At-ZH和At-T35扩增出此特异片估，从而进一步肯定了T-DNA已被整合到泡桐的染色体上表明泡桐易于通过Ti质粒载体途径进行基因转移操作，但用此引物未能从泡桐、甘薯健株和感染植原体的组培病苗扩增出相应的427bp特异片段，当用此遗传转化瘤组织嫁接病苗时，可减轻从枝症状的严重度，延长病苗的存活时间和诱导病株生根，这进一步证实了泡桐在与植原体相互作用过程中激素代谢发生了变化。 相似文献
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Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 carrying pBI121 plasmid was used to transform mature zygotic embryos of three genotypes (E-Hb, E-Ma, and
E-Mc) of loblolly pine. The results demonstrated that the expression frequency of β-glucuronidase reporter gene (GUS) varied
among genotypes after mature zygotic embryos were infected withAgrobacterium tumefaciens cultures. The highest frequency (27.8%) of GUS expressing embryos was obtained from genotype E-Mc with mean number of 21.9
blue GUS spots per embryo. Expression of β-glucuronidase reporter gene was observed on cotyledons, hypocotyls, and radicles
of transformed mature zygotic embryos, as well as on organogenic callus and regenerated shoots derived from co-cultivated
mature zygotic embryos. Nineteen regenerated transgenic plants were obtained from GUS expression and kanamycin resistant calli.
The presence and integration of the GUS gene was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analysis.
These results suggested that an efficientAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation protocol for stable integration of foreign genes into loblolly pine has been developed and that this transformation
system could be useful for the future studies on transferring economically important genes to loblolly pine. 相似文献
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In a 3-year field study, the effects of substitution of nitrogen requirement of maize through Leucaena leaves were studied on runoff, soil loss, maize and wheat yield and economic returns. The treatments were (1) 80 kg N ha-;1 all through Leucaena leaves (80 L), (2) 40 kg N through Leucaena leaves + 40 kg N ha-;1 through fertilizer (40 L + 40 F), (3) 20 kg N through Leucaena leaves + 60 kg N ha-;1 through fertilizer (20 L + 60 F), (4) 80 kg N ha-;1 all through fertilizer (80 F), and (5) control (No fertilizer). Green Leucaena leaf biomass (containing 3.3% N on dry basis) was incorporated every year in 15 cm top soil two weeks before sowing of summer maize.Other treatments being almost equal, runoff was reduced marginally in treatment 20 L + 60 F which was attributed to better crop growth in this treatment. Mean minimum soil loss (6.202 t ha-;1) also occurred in treatment 20 L + 60 F. Soil loss in 80 L was 13% less than in 80 F. Maize yield was at par in 80 L and 80 F. However, mean maximum yield of maize was obtained with 20 L + 60 F.Residual effect of incorporation of Leucaena leaves to maize crop was observed on wheat yield. The mean yield differences were statistically at par in all the treatments except control. The total mean net returns were statistically at par in 80 L and 80 F. However, significantly higher mean net returns (Rs 6811 ha-;1; one US$ = Rs30) were obtained with 20 L + 60 F. Substitution of N through Leucaena leaves even in small quantity may be helpful to small holders, particularly where chemical fertilizers are in short supply or too expensive. 相似文献
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[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。 相似文献