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1.
摘要：将原核表达的重组马-干扰素成熟蛋白（mEIFN-）免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马-干扰素作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选到15个阳性细胞株。分别经过3轮亚克隆后,最终得到了12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光（IFA）实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对马-干扰素的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b、3株为IgM,而且所有单克隆抗体的轻链均为链。将此12株单克隆抗体分别与用原核系统分节段表达的重组马-干扰素GST-mEIFN-(1-84)、GST-mEIFN-(80-146)蛋白进行特异性ELISA检测,结果表明有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-(1-84),而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-(80-146)发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。这将为今后建立马-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。 相似文献
2.
以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。 相似文献
3.
应用实时荧光定量RT-PCR方法评价了大肠杆菌表达的重组马白细胞介素-18（rEIL-18）蛋白在商品化的重组人IL-12（rhIL-12）协同作用下刺激马外周血单核细胞（PBMCs）产生EIFN-gamma的情况。在rhIL-12的协同作用下,rEIL-18在体外刺激马PBMCs产生EIFN-gamma的效应是阴性对照的20倍之多,并且在一定rhIL-12浓度的条件下,rEIL-18在体外诱导马PBMCs产生EIFN-gamma的能力是呈一定的剂量依赖性。此外,评价了制备的9株抗rEIL-18单克隆抗体中和rEIL-18的生物学活性的能力,证实其中1株可中和rEIL-18的生物学活性,并且呈一定的剂量依赖性。结果表明：首次获得原核表达的具有生物活性的rEIL-18,其活性可被1株抗rEIL-18单克隆抗体中和。 相似文献
4.
将牛白细胞介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中，并在宿主菌BL21（DE3）中进行表达；用BoIL-18在昆虫细胞中的表达产物制备的兔多克隆抗体作为一抗进行Western blot分析；采用亲和层析法，对表达产物进行纯化；利用MTT染色法研究重组BoIL-18（re BoIL-18）对牛外周血单核细胞(PBMC) 增殖的促进作用；采用双抗体夹心ELISA法研究reBoIL-18诱导脾淋巴细胞产生IFN-γ的情况；采用微量细胞病变抑制法检测reBoIL-18对VSV导致细胞病变的抑制作用。结果:得到了BoIL-18的高效表达产物，表达量为31.8％，Western blot 显示，在44KD处有一特异性条带；纯化后获得了纯度较高的reBoIL-18蛋白；纯化的BoIL-18对PBMC增殖具有明显的促进作用，并且能够促进IFN-γ的诱生和抑制VSV病毒的活性。 相似文献
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水牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将原核表达的重组水牛(Bubalus bubalis)γ-干扰素成熟蛋(rGST-WBIFN-γ)以100 μg/只剂量免疫8周龄Balb/c小鼠(Mus musculus),经5次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以rHIS-WB-IFN-γ和rGST-WBIFN-γ蛋白共同作为检测抗原进行间接ELISA检测,筛选并最终得到了2株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株(分别命名为IE4和4A11),分泌抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链.Western-blotting检测显示:2株单克隆抗体与原核表达的rWBIFN-γ蛋白均能特异性结合,具有良好的免疫反应原性. 相似文献
6.
分别以鸡白细胞介素18成熟肽基因(mChIL-18)和鸡α-干扰素成熟肽基因(mChIFN-α)为模板,通过PCR及PCR重叠延伸技术(SOE)得到融合基因mChIL-18mChIFN-α。将融合基因克隆于pGEM-T Easy载体后,再亚克隆到原核表达载体pQE30,并进行测序。测序结果表明获得了阅读框完整、连接部位正确的融合基因mChIL-18mChIFN-α。SDS-PAGE可检测到分子质量为39.4kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。 相似文献
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猪传染性胃肠炎(swine transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,是我国法定检疫的疫病。为研究福建省猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)核衣壳蛋白基因(N)的分子特征及其原核表达产物的抗原性,参照GenBank中的TGEV全基因序列,设计合成一对扩增TGEV福建(FJ)分离株N基因的特异性引物,进行克隆和序列分析,结果表明,TGEV-FJ株N基因全长1149bp,编码382个氨基酸(GenBank登录号JQ700302),与国内外23株TGEVN基因的核苷酸同源性,氨基酸同源性进行比较分析,N基因核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。TGEV-FJ株N基因克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白约为68kD,与预期分子量一致;Western blot分析表明,重组蛋白能与抗TGEV阳性血清反应出现特异性条带;以纯化的重组TGEVN蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性,送检20份猪(Sus scrofa)TGEV阳性血清样本中检出16份阳性结果、10份阴性血清样本中检出9份阴性结果。利用纯化的TGEV重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了1株特异性好并能稳定分泌抗TGEVN蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1-27),间接免疫荧光试验证明,该单抗能特异性识别TGEV全病毒抗原。TGEVN蛋白的单克隆抗体制备为建立TGEV免疫学检测方法提供了基础资料。 相似文献
8.
本研究旨在制备抗鸭β-防御素9(AvBD9)蛋白的单克隆抗体.首先用pGEX-6p-1载体表达的鸭AvBD9蛋白做抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠(Mus musculus),免疫3次,每次间隔15 d,融合前3 d加强免疫1次.然后将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pET-32a的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET-32a-duckAvBD9,将重组质粒转化至大肠杆菌(Escheriohia coli)BL21(JM83-)株,经IPTG诱导表达、镍柱纯化后做检测原.用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western blot相结合的方法进行筛选及鉴定,经3次亚克隆后得到1株单抗,命名为1F11.结果表明:重组pET-32a-duckAvBD9蛋白大小为26kD,与预期大小一致,并能被抗pGEX-duck AvBD9阳性血清识别.单抗1F11在pGEX-6p-1空载体蛋白、pGEX-duck AvBD9蛋白、pGEX-duck AvBD10蛋白、pGEX-chicken AvBD10蛋白中能够特异性识别pGEX-duckAvBD9蛋白.其亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链.本研究获得了1株鸭AvBD9蛋白的单克隆抗体,单抗1F11的特异性良好,可用于对鸭AvBD9蛋白的生物学功能及活性作进一步研究. 相似文献
9.
牛IL-18融合蛋白的原核表达及生物学活性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
将牛白细胞介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)获得重组菌株。该重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳表明,BoIL-18融合蛋白获得了高效表达,分子量约为44kD,凝胶薄层扫描分析显示,融合蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;用亲和层析法对表达产物进行纯化,检测纯化产物的生物学活性。对外周血单核细胞(PBMC)的增殖实验证明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对PBMC有明显的增殖作用;对IFN-γ的诱生实验显示,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20mg/L时,能促进IFN-γ的产生,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强。 相似文献
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鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测 总被引：2，自引：0，他引：2
对含有鸡白细胞介素-18(ChIL-18)基因的质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)内进行诱导表达,经亲和层析法对表达产物进行纯化,用微量细胞病变抑制法CEF-VSV系统,检测其对SPF鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)的活性和其对病毒的抑制效果;用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测其对T淋巴细胞诱导转化和NK细胞杀伤活性的作用。结果表明,经诱导表达出分子量44kD的目的蛋白(与GST融合表达),纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白;该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ,当浓度为250ng/mL时诱导IFN-γ的活性最高,可达1×106U/mL;但该蛋白不能直接抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长;能够刺激淋巴细胞显著增殖,浓度为250ng/mL时效果最佳;适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK细胞的杀伤活性,浓度为150ng/mL时,作用最强。利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白与天然鸡IL-18蛋白一样具有较广泛的生物学活性。 相似文献
11.
应用RT-PCR技术,直接从麻鸭(Tadorna ferruginea)脾淋巴细胞总RNA中扩增出麻鸭IL-18成熟蛋白(mDuIL-18)基因,克隆到pGEM-T Easy载体。测序结果表明获得了mDuIL-18基因,其大小为513bp,并将该基因亚克隆到原核表达载体pQE30。SDS-PAGE可检测到分子质量为19.76kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在,经变性和复性处理后明显促进鸭T细胞转化。用mDuIL-18(150或200ng/鸭)和禽流感病毒(AIV)疫苗免疫鸭2周后,血凝抑制(HI)抗体平均滴度达到7.5～7.7log2,而只用AIV疫苗免疫和用mDuIL-18(100ng/鸭)和AIV疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3～6.6log2,表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。 相似文献
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以NOAA卫星数据为基础,建立了利用RS和GIS技术估算光能利用率的一种新方法。并以北京地区为例,利用2007年的NOAA18 1B卫星资料和20个气象站点的数据,研究了北京地区植被光能利用率及其时空格局,并分析了NDVI与光能利用率的关系。结果表明：利用NOAA18卫星资料能较好地估算北京地区植被光能利用率;北京地区植被的年光能利用率为0.04%-1.06%,平均为0.57%,年最大值为2.83%;落叶阔叶林的光能利用率为0.74%,灌丛为0.51%,农田为0.50%;光能利用率的高值区主要分布在北部山区森林,低值区分布于城区;四季的光能利用率变化明显,春夏秋冬季分别为0.31%、1.37%、0.49%和0.04%;利用年NDVI最大值可以较好地模拟年光能利用率。 相似文献
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Margarita Ros Jose Antonio Pascual Ma Teresa Hernández Carlos García 《Biology and Fertility of Soils》2009,45(4):435-441
A stable plant cover is essential in the semi-arid soils of the Mediterranean area to maintain their fertility and functionality.
In a semi-arid area, we have studied abundance, structure, and presence of active species of fungal communities of a devegetated
soil (disturbed soil) and vegetated soil (undisturbed soil). Disturbed soil was covered by small spontaneous vegetation (5–10%)
compared to undisturbed soils (70%), and this decreased the content of the total organic C, microbial biomass, microbial activity
(adenosine triphosphate), and fungal counts. The composition and activities of fungal communities were also investigated by
direct extraction of DNA and RNA from soil. Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 18S ribosomal DNA and 18S
ribosomal RNA profiles indicated that total and active fungal communities were changed after vegetation removal. 相似文献
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成纤维生长因子18(fibroblast growth factor 18,Fgf18)是一种分泌型的信号分子,参与小鼠(Mus musculus)和绒山羊(Capra hircus)毛发生长及毛周期的调控.本研究克隆了小鼠Fgf18基因CDS区的片段,并将其连接于超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin,UHS)启动子的下游.Sac Ⅰ、BglⅡ、SphⅠ和EcoT14 Ⅰ的酶切鉴定结果表明,成功构建了Fgf18基因毛囊特异表达载体pUHS-Fgf18.原核注射线性化pUHS-FGF18,共获得3只转基因小鼠.RT-PCR检测结果表明,Fgf18基因在转基因小鼠皮肤中的表达明显高于对照小鼠(P＜0.05).转基因小鼠NO.205皮肤中Fgf18的表达量明显高于对照小鼠(P＜0.05),而肝脏、肾脏、心脏、睾丸、骨骼肌、脾、脑、肺、胃和小肠等组织则与对照小鼠无显著性差异(P＞0.05).Westem blot的结果表明,转基因小鼠皮肤的Fgf18蛋白水平显著高于对照组(P＜0.05).同时本研究利用RT-PCR的方法检测了转基因小鼠中Fgf18基因的拷贝数,其拷贝数在8～210.本研究成功建立了毛囊特异表达Fgf18基因的转基因小鼠模型,不仅可为进一步研究Fgf18基因在毛周期及毛发生长中的功能及其作用机理提供必要的工具和手段,也可为生产Fgf18基因修饰的转基因绒山羊提供一定的理论基础. 相似文献
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以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出犬IL-2成熟蛋白基因，将目的片段连接到pMD18-T载体，测序结果显示，扩增片段与GenBank上发表的序列一致。然后将目的片段连接到酵母表达载体pPICZa-A上，得到重组酵母犬IL-2表达载体pPICZaA-CaIL-2，经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR方法筛选重组酵母菌，甲醇诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达上清中有大小约20kDa的目的条带，比实际分子量略大，推测蛋白可能发生糖基化。MTT法测定生物学活性结果表明，重组犬IL-2能够极显著促进犬外周血淋巴细胞增殖。证明酵母表达的犬重组IL-2具有良好的生物学活性。 相似文献
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根际是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面。植物作为第一生产者同化大气CO2,将部分光合产物转运至地下,激发土壤微生物的生长和新陈代谢;土壤微生物则将有机态养分转化成无机形态,利于植物吸收利用。这个植物-微生物的互作关系维系和主宰着陆地生态系统的功能。自从100年前德国科学家LorenzHiltner提出根际概念以来,根际研究方兴未艾,研究内容不断得以丰富和发展。近年来,随着分子生物技术在土壤环境领域的应用,根际微生物研究出现快速发展的趋势。本文根据2004年在慕尼黑召开的第一届国际根际大会交流内容、结合近年来国际上报道的研究动向,对根际微生物研究方法、根际微生物生物多样性和生态功能、转基因生物的环境安全和根际微生物生物修复技术等内容作一综述。期望我国的根际微生物研究能在基础和应用领域得到快速发展。 相似文献