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1.
《中国畜牧兽医》2020,(2)
本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调(P0.01);细胞外基质中纤连蛋白(FN)和层连接蛋白(LN)含量均极显著增加(P0.01)。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞(P0.01);Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。 相似文献
2.
本研究旨在揭示肌抑素（MSTN）与基质金属蛋白酶（MMPs）的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系：单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调（P < 0.01）;细胞外基质中纤连蛋白（FN）和层连接蛋白（LN）含量均极显著增加（P < 0.01）。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞（P < 0.01）;Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。 相似文献
3.
CRISPR/Cas9介导的猪IPEC-J2细胞CD13基因敲除细胞系的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13, CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA, gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。 相似文献
4.
通过敲除猪的ApoE基因,为后期构建ApoE缺陷型动物模型奠定基础。利用CRISPR/Cas9系统和实验室前期构建的报告载体,分别构建了靶向猪ApoE基因的两个CRISPR/Cas9表达载体和相应的报告载体。通过CRISPR/Cas9表达载体和RG(Red-GFP)报告载体转染HEK 293T细胞荧光观察结果显示,构建的CRISPR/Cas9表达载体均有较高的活性,进一步在流式细胞仪上检测其活性分别为6.50%和6.83%。将CRISPR/Cas9表达载体和RPG(Red-PuroR-GFP)报告载体转染PK15细胞系,经过嘌呤霉素药物筛选后,对富集到的细胞进行基因组检测。结果显示本系统能够对猪PK15细胞中的ApoE基因进行有效的敲除,其敲除效率分别为40%、53.3%。试验结果可为ApoE敲除猪动物模型的构建提供理论依据。 相似文献
5.
试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3~(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3~(-/-)细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3~(-/-)细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3~(-/-)病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P0.05),但PK15-IRF3~(-/-)细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2017,(10)
旨在进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的调控机制,制备可有效失活MSTN基因的工具,为通过RNA干扰技术提高绵羊产肉量提供方法和理论依据。本研究以绵羊成肌细胞为试验材料,构建特异靶向绵羊MSTN基因的shRNA干扰质粒载体,将干扰效果好的质粒进一步包装为重组腺病毒,转染细胞后采用qRT-PCR和Western blot检测MSTN基因以及生肌调节因子和干扰素反应基因的表达。结果表明,质粒ShR218和ShR511干扰MSTN基因效率分别达到35%和48%,双元干扰质粒ShR3+4干扰效率最高达到85%。成功包装shRNA重组腺病毒载体Sh511和Sh3+4,病毒滴度达到1×10~8 pfu·mL~(-1),对成肌细胞的感染效率达到90%以上。Sh511和Sh3+4对MSTN基因mRNA的表达抑制分别达到53%和76%,对蛋白表达抑制分别达到55%和64%。MSTN基因沉默后,伴随着Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因mRNA水平的极显著性下调(P0.01),但只引起MyoG蛋白水平极显著升高(P0.01),未引起Myf5、MyoD、Myf6蛋白水平的显著变化;腺病毒感染成肌细胞未引起OAS1基因mRNA水平的显著变化,但引起IFNGR1基因mRNA水平的极显著升高(P0.01),对二者蛋白水平均无显著影响。本研究成功构建靶向MSTN基因的shRNA腺病毒载体,能有效抑制成肌细胞MSTN的mRNA和蛋白表达,并影响生肌调节因子Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因和干扰素受体基因IFNGR1表达。 相似文献
7.
试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。 相似文献
8.
试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因敲除的猪回肠上皮（immortal pig intestinal-2I,IPI-2I）细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体（pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5）共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞（片段敲除效率为15.5%）,其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。 相似文献
9.
【目的】利用单碱基编辑器在宁乡花猪肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因第2外显子处引入终止密码子,以获得MSTN基因表达沉默的肾成纤维细胞系,为后期培育MSTN碱基编辑猪奠定基础。【方法】首先在MSTN基因的第2外显子处设计1条单向导RNA (single guide RNA,sgRNA),将其连接至pMLM3636-puro质粒,形成重组表达载体pMLM3636-puro-MSTN,与含有红色荧光碱基编辑器YE1-BE3-FNLS共转入宁乡花猪肾成纤维细胞中,在红色荧光和嘌呤霉素双筛选条件下,挑取单克隆细胞,测序验证后,分析阳性单克隆细胞的蛋白表达情况。【结果】在MSTN基因第2外显子处发生了碱基定点突变,目标位点的氨基酸序列由色氨酸(TGG)转变成终止密码子(TAA),且G→A突变率为5.5%。Western blotting检测结果表明,试验组10号单克隆细胞的MSTN蛋白表达量与野生型相比降低了60%。【结论】本研究运用单碱基编辑技术在宁乡花猪MSTN基因编码区引入终止密码子,使翻译提前终止,导致蛋白表达量显著降低,为后期MSTN基因碱基编辑猪的生产奠定基础。 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2020,(7)
在实验室前期利用猪肾细胞(PK-15)CRISPR/Cas9全基因组敲除文库(PK-15-GeCKO)筛选到猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶(ALG5)的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA(gRNA)的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮(NPTr)细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID_(50)和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示:获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系(ΔALG5),ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。 相似文献
11.
为了研究无翅基因相关整合位点2(Wnt2)在绵羊毛囊发育中的作用,通过CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术在绵羊原代皮肤成纤维细胞中敲除Wnt2基因,经T7E1酶切试验进行敲除结果验证,实时荧光定量PCR分析Wnt2、E-钙黏蛋白(CDH1)、半光天冬氨酸酶3(Caspase3)和成纤维细胞生长因子5(FGF5)在敲除后的表达量变化。结果显示:绵羊原代皮肤成纤维细胞中Wnt2基因敲除成功,编辑效率约14.35%;Wnt2相对表达量极显著下调(P0.01),CDH1相对表达量极显著上调(P0.01),Caspase3及FGF5表达上调显著(P0.05)。结果表明:Wnt2基因对毛囊的生长发育具有促进作用。 相似文献
12.
旨在研究PNPLA5基因对雄性大鼠繁殖性能的影响。本研究以PNPLA5敲除型雄性大鼠(KO)为试验组,野生型大鼠(WT)为对照组,分别饲喂普通饲料,并采集大鼠附睾精子及睾丸组织。利用繁殖试验检测配种后雌鼠的妊娠率及平均产仔数,精子运动性能分析检测精子运动能力,Western blot检测精子中线粒体功能相关细胞色素C(cytochrome C,Cytc)与细胞色素C氧化酶亚基IV(cytochrome c oxidase subunit IV,COX IV)的表达水平,HE染色检测睾丸组织形态。结果表明:与野生型雄性大鼠相比,PNPLA5敲除型雄鼠与野生型雌鼠配种后,雌鼠的妊娠率极显著下降(P<0.01);精子的曲线运动速度显著降低(P<0.05)及渐进运动精子的百分率极显著降低(P<0.01);PNPLA5敲除型大鼠精子中细胞色素C表达量下调,细胞色素C氧化酶亚基IV表达量上调,但差异均不显著(P>0.05);PNPLA5基因缺失引起大鼠睾丸组织结构疏松,曲细精管中各阶段生精细胞排列紊乱,上皮细胞脱落至管腔。综上表明,本研究发现PNPLA5基因敲除能够引起雄性大鼠繁殖能力降低,为家畜繁殖研究提供重要的参考依据。 相似文献
13.
《畜牧与兽医》2021,(10)
为研究肌纤维发育相关基因在不同地方鸡种的表达调控作用,选用1日龄体重相近的汶上芦花鸡、济宁百日鸡和鲁西斗鸡,分别在1日龄、1～5周龄采集同一部位的胸肌、腿肌,应用实时荧光定量PCR测定Myf5、Myf6、MyoD1和MSTN等基因的表达量。结果显示:汶上芦花鸡胸肌中MSTN基因1周龄表达量显著高于其他周龄(P0.05),鲁西斗鸡腿肌中MSTN基因4周龄表达量显著高于其他周龄(P0.05),济宁百日鸡胸肌中MSTN基因4周龄和5周龄表达量显著高于其他周龄(P0.05),腿肌中4周龄显著高于其他周龄(P0.05);汶上芦花鸡腿肌Myf6基因2周龄的表达水平明显高于其他周龄(P0.05),济宁百日鸡胸肌中Myf6基因5周龄时表达量显著低于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P0.05);4～5周龄时,济宁百日鸡腿肌MyoD1基因的表达水平最低,在3周龄时,汶上芦花鸡胸肌MyoD1基因表达水平显著高于其他周龄(P0.05);在0和1周龄时,鲁西斗鸡中胸、腿肌Myf5基因表达水平均高于汶上芦花鸡和济宁百日鸡。研究表明Myf5、Myf6、MyoD1和MSTN基因在3个地方鸡种胸肌、腿肌中均呈现出不同的表达调控模式。 相似文献
14.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(17)
CRISPR/Cas9系统作为第3代人工核酸内切酶,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节肌肉的生长,影响动物的产肉量。为了获得MSTN基因敲除的细胞株,给转基因动物的制备提供材料,试验利用CRISPR/Cas9系统的不同类型的表达载体对牛MSTN基因外显子序列随机设计靶位点,利用T7核酸内切酶I(T7EI)从中挑选出敲除效率最高的靶位点的表达载体,在无筛选标记条件下对牛胎儿成纤维细胞进行基因敲除。结果表明:经过长时间培养获得了基因敲除的细胞株。说明CRISPR/Cas9技术用于基因敲除方面的研究应用前景广阔。 相似文献
15.
干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响 总被引：6，自引：1，他引：5
旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。 相似文献
16.
为了探讨不同品种肉兔肌肉生长抑制素(MSTN)和肌细胞生成素(MyoG)表达水平差异及其与屠宰性状的关联性,试验采用实时荧光定量PCR方法比较齐卡巨型白兔和加利福尼亚兔背最长肌MSTN和MyoG基因的表达水平。结果表明:84日龄时,齐卡巨型白兔背最长肌MSTN基因表达量极显著低于加利福尼亚兔(P0.01),而MyoG基因表达量极显著高于加利福尼亚兔(P0.01)。相关分析结果表明,MSTN基因表达量与宰前活重和日增重呈极显著负相关(P0.01),与全净膛率呈显著负相关(P0.05);MyoG基因表达量与宰前活重及全净膛率呈极显著正相关(P0.01),与日增重呈显著正相关(P0.05)。说明MSTN和MyoG表达量与不同品种家兔在84日龄的体重差异可能有直接关系。 相似文献
17.
TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。 相似文献
18.
《中国兽医学报》2020,(2):257-263
利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID_(50)测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。 相似文献
19.
为探讨蒙古马高负荷调教训练前后MSTN、CKM基因的表达情况,实验首先采用SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法对4个常用内参基因(TTN、18s r RNA、GAPDH、β-actin)在臀中肌内的稳定性进行评估;确定内参基因后,对MSTN、CKM基因转录水平进行测定。结果表明:在蒙古马臀中肌中稳定度依次为GAPDH(1.087)β-actin(1.211)TTN(1.285)18s r RNA(1.460),选取稳定度最高的GAPDH基因作为内参基因;高负荷运动训练后MSTN基因m RNA表达量较训练前上调,而CKM基因则下调。本研究为蒙古马运动性能相关基因的研究奠定了基础。 相似文献
20.
《动物医学进展》2021,42(10)
为研究血红素结合蛋白1(HEBP1)对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的影响,应用CRISPR/Cas9技术建立HEBP1基因敲除的MDBK细胞系;用BVDV TC株感染HEBP1基因敲除的MDBK细胞,用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA(dsRNA)水平,观察BVDV致细胞病变效应(CPE)情况,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench测定病毒滴度变化。结果表明,成功构建HEBP1基因敲除的MDBK稳定细胞系,敲除效率为72.41%;敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA积累,减弱BVDV感染靶细胞的CPE,降低BVDV滴度。说明敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV的复制,为抗BVDV研究提供新的思路和药物靶点。 相似文献