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1.
为了提高体细胞核移植的效率,试验探讨了转染外源性hTERT基因对核移植供体细胞———牛耳成纤维细胞的影响。试验应用脂质体介导hTERT基因转染,用相差显微镜观察转染前后的细胞状态,用RT-PCR、W estern blot法检测hTERT基因是否整合并表达,用流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化和凋亡的情况,并进行核型分析。结果表明:转染48 h后能看到明显的荧光,经600μg/mLG418筛选后,获得阳性克隆,转染后的细胞形态上基本无变化,hTERT基因整合并表达;经流式细胞仪检测,转染前后生长周期无明显变化,凋亡率极显著降低(P<0.01),核型正常;转染hTERT基因后的牛耳成纤维细胞的凋亡率显著低于未转染的细胞,并且形态正常,表明转染hTERT后,使体外培养的牛耳成纤维细胞生命力得到延长,为核移植提供了数量更多的高质量的核供体细胞。 相似文献
3.
将猪白介素4(Porcine interleukin4,PIL-4)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pEGFP-PIL-4,利用脂质体法转染CHO-K1细胞,采用荧光显微镜实时观察、RT-PCR和Western-blot分别检测CHO细胞转录表达目的分子的情况,通过MTT法检测所表达蛋白的生物学活性。结果在将重组质粒转染CHO-K1细胞中24、48 h后的均观察到绿色荧光;经G418筛选14~20 d后转染的细胞形成了阳性细胞集落,用RT-PCR扩增出约339 bp的目的基因片段;经Western-blot检测到约为39 000的特异蛋白分子条带,并证明在转染重组质粒的细胞中表达了高生物活性的重组蛋白。 相似文献
4.
用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。 相似文献
5.
《中国畜牧杂志》2021,(9)
本研究旨在培养符合实验要求的牛胎盘滋养层细胞,并探究外源hTERT基因对细胞生长及功能特性的影响。利用联合组织块培养法、胰蛋白酶消化法获得原代牛胎盘滋养层细胞,利用脂质体转染pc1-neohTERT质粒,通过WesternBlot检测细胞角蛋白7(Cytokeratin7,CK7)和波形蛋白(Vimentin)的表达,又通过免疫组化检测胎盘催乳素(Placental Prolactin,PL)和绒毛膜促性腺激素(Chorionic Gonadotropin,CG)等的表达。结果表明:研究中培养获取的原代牛胎盘滋养层细胞90%以上可表达特异性角蛋白CK7,转染质粒后细胞可连续稳定传代15代以上,且CG和PL的分泌量与原代细胞相比无显著差异,证明转染质粒对细胞主要功能及生长特性没有明显影响,细胞可用于后续实验。 相似文献
6.
为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞（EEC）,本试验将含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达质粒pCI—neo—hTERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状。与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol／L的雌二醇（E2）可促进该细胞的增殖;50,100nmol／L的孕酮（P4）可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。 相似文献
7.
山羊子宫内膜上皮细胞转染pCI-neo-hTERT质粒后的永生化 总被引：2，自引：1，他引：1
为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞(EEC),本试验将含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达质粒pCI-neo-hT ERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状,与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol/L的雌二醇(E2)可促进该细胞的增殖;50,100nmol/L的孕酮(P4)可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。 相似文献
8.
为提高鸡球虫病活疫苗的免疫效果并降低其副作用,本试验用合成的鸡白介素2(chIL-2)和鸡白介素4(chIL-4)基因片段构建3个融合基因真核表达质粒,并利用脂质体法将其转染至原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其表达水平,MTT法测定其表达的分泌产物活性。结果显示：成功构建的pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP、 pCI-chIL-4-EGFP重组真核表达质粒能在原代鸡胚盲肠上皮细胞中高效表达;3种重组真核表达质粒转染后24～96 h的鸡脾淋巴细胞活性极显著高于空载组(P<0.01),且在72 h时达峰值;而单一因子组鸡脾淋巴细胞增殖活性极显著低于pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP组(P<0.01)。由此可见,本试验成功构建了能表达分泌chIL-2和chIL-4的融合基因重组质粒;且chIL-4-chIL-2融合蛋白生物学活性显著高于单一因子。 相似文献
9.
《中国兽医学报》2016,(12):2049-2053
采用基因工程技术克隆出梅花鹿α干扰素(IFN-α)成熟肽基因序列,并将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0(+),经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.0-IFN-α真核重组表达质粒。将鉴定正确的阳性重组质粒经非脂质体法转染至MDBK细胞,间接免疫荧光试验检测其具有较高转染效率;Western blot法检测IFN-α蛋白在MDBK细胞中得到有效表达;病变抑制试验检测转染后的MDBK细胞具有明显抗BVDV活性;抗BVDV活性的定量试验表明转染pcDNA3.0-IFN-α质粒的MDBK细胞与感染未转染的MDBK细胞相比抗BVDV活力提高了66192倍。本试验在MDBK细胞中成功表达了梅花鹿IFN-α,并检测出其具有明显抗BVDV作用,这为梅花鹿IFN-α活性机理研究以及开发更高效的抗梅花鹿病毒性疾病干扰素制剂提供物质和理论基础。 相似文献
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旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免疫荧光法鉴定其角蛋白18(CK18)和人端粒酶逆转录亚基(hTERT)表达情况;RT-PCR检测其hTERT mRNA的表达;采用CCK-8法绘制细胞生长曲线检测其增殖能力;利用流式细胞仪检测其周期和细胞凋亡情况;核型分析检测其倍体情况;从mRNA和蛋白水平检测其谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)和雄激素受体(AR)的表达情况。结果显示,原代绵羊附睾上皮细胞呈典型的铺路石状形态。hTERT成功转入绵羊附睾上皮细胞,传45代后,hTERT-SEECs仍呈铺路石状;hTERT-SEECs仍可稳定表达CK18和hTERT,并且拥有正常的二倍体核型;hTERT-SEECs增殖能力高于原代细胞,hTERT-SEECs处于G1期的细胞比例显著低于SEECs(P0.05),处于S期细胞比例显著高于SEECs(P0.05),且其活细胞率显著高于SEECs(P0.05),凋亡率显著低于SEECs(P0.05); hTERT-SEECs和SEECs的GPX5和AR蛋白表达量差异不显著(P0.05)。本研究所建立的hTERT-SEECs经长期培养后仍具有正常的附睾上皮细胞形态,增殖能力强并保留了附睾上皮细胞的生物学特性。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(7)
为探讨过表达的第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)对犬乳腺肿瘤细胞系(CHMm)增殖及Bcl-2、Bax基因的影响,本研究构建了PTEN表达质粒pc DNA-PTEN,采用脂质体转染法将其导入CHMm细胞系,采用western blot检测PTEN蛋白表达情况,CCK-8法检测CHMm细胞增殖情况,荧光定量PCR检测Bcl-2和Bax的基因表达情况。结果显示,转染PTEN的CHMm细胞组的PTEN蛋白表达水平显著高于空载体组和未转染组;转染PTEN细胞组的细胞增殖显著低于空载体组和未转染组(p0.05);转染PTEN的CHMm细胞组Bcl-2的m RNA表达水平显著低于空载体组和未转染组(p0.05);转染PTEN的CHMm细胞组Bax的m RNA表达水平显著高于空载体组和未转染组(p0.05)。本实验将PTEN基因导入犬乳腺肿瘤细胞系(CHMm),抑制犬乳腺肿瘤细胞增殖,为寻找乳腺肿瘤基因治疗新方法提供依据。 相似文献
14.
为了研究gB蛋白在细胞内的作用位点,试验以猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)SA株为模板,设计特异性引物,扩增gB基因保守片段;以pEGFP-N1质粒为模板扩增EGFP基因;以gB基因与EGFP基因胶回收产物为模板,用gB基因上游引物及EGFP基因下游引物通过重叠延伸PCR(SOE PCR)技术获得gB/EGFP融合基因;构建pcDNA3.1/gB/EGFP重组表达质粒,转染乳仓鼠肾细胞(BHK细胞),采用Western-blot技术及荧光显微镜检测荧光蛋白在细胞内的表达情况。结果表明:试验成功扩增到300 bp的gB基因、760 bp的EGFP基因及1 060 bp的gB/EGFP融合基因;成功构建出pcDNA3.1/gB/EGFP重组表达质粒并转染BHK细胞;Western-blot技术及荧光显微镜检测显示,融合蛋白在BHK细胞中成功表达。说明通过荧光蛋白研究目的蛋白的作用位点是可行的。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(12):2350-2357
几乎所有类型的人类肿瘤都可以检测到端粒酶的活性,通过抑制端粒酶逆转录酶基因(TERT)表达降低端粒酶活性可能是进行抗肿瘤治疗的一个新靶点。本试验通过构建靶向端粒酶TERT基因的shRNA(Sh1,Sh2和Sh3)表达质粒载体转染MDCC-MSB1细胞抑制chTERT基因表达,从而降低端粒酶活性及细胞增殖。Real-time PCR结果显示,Sh1和Sh3在质粒载体转染细胞后48,72,96h显著抑制chTERT基因表达(P<0.05),且呈持续效果;TRAP法端粒酶活性分析显示,Sh1和Sh3在质粒转染细胞72h显著降低端粒酶活性;流式细胞分析显示,Sh3在转染后72h显著降低了S期细胞的比例(P<0.01),G2/M期细胞比例显著上升(P<0.01),G0/G1期细胞比例没有明显变化(P>0.05),抑制了MDCC-MSB1细胞的增殖。结果提示,shRNA通过抑制TERT基因表达可有效降低端粒酶活性,阻滞肿瘤细胞的增殖,为抗癌症治疗提供了新的备选方案及具有参考价值的基础科学数据。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(11)
为了获取Ipr1基因全长编码序列,构建与EGFP基因融合的表达载体,观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞中的表达情况及对细胞生长状态的影响,试验通过RT-PCR方法获得Ipr1基因,将获得的Iprl基因片段与pEGFP-C1载体片段连接后获得真核表达质粒pEGFP-Ipr1,经PCR、酶切鉴定正确后,脂质体瞬时转染pEGFP-Ipr1至第5代的小鼠腹腔巨噬细胞内,以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照,采用Western-blot检测Ipr1基因的表达并用荧光显微镜观察融合蛋白的表达情况。结果表明:研究构建了真核表达载体pEGFP-Ipr1并进行了Ipr1基因转染,通过Western-blot检测在大约50 ku处有目的条带,转染24 h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染Ipr1基因的小鼠腹腔巨噬细胞株。说明试验获得了易于转染的小鼠腹腔巨噬细胞株,成功转染了Ipr1基因并得以表达。 相似文献
19.
为了研究淋巴细胞活化基因-3蛋白的生物学特性,试验采用PCR方法扩增淋巴细胞活化基因-3胞外区序列,构建重组质粒,将重组质粒转染至HEK293感受态细胞中表达目的蛋白,并对目的蛋白进行SDS-PAGE及Western-blot检测,通过ProtParam软件分析淋巴细胞活化基因-3蛋白性质,通过SWISS-MODEL软件预测蛋白质结构。结果表明:PCR法成功扩增出目的条带,大小约为1 430 bp,1. 0%琼脂糖凝胶电泳显示酶切成功;经10%SDS-PAGE凝胶电泳分析,在68 ku处出现目的条带,目的蛋白成功表达;纯化后的蛋白质经Western-blot检测证明具有特异性;目的蛋白具有22种可能的折叠形态,理论等电点pI值为9. 08,蛋白质结构不稳定,亲水性较差。说明试验成功表达了淋巴细胞活化基因-3蛋白。 相似文献
20.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(5)
为了构建猪胰岛素启动子(IP)-绿色荧光蛋白(GFP)报告系统,评价其在胰岛间充质干细胞(PIMSCs)诱导分化过程中的应用价值,试验以胎猪胰腺组织基因组DNA为模板,PCR扩增获得IP基因片段,T载体连接测序后,构建p EGFP-IP重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后,分别转染原代胎猪胰腺细胞和PIMSCs,48 h后观察荧光表达情况,转染重组质粒的PIMSCs体外诱导2周后,观察绿色荧光表达情况,并进行GFP和胰岛素的Western-blot检测。结果表明:PCR扩增得到1条659 bp大小的基因片段,其测序结果与Gen Bank公布的IP基因序列一致。经PCR和双酶切鉴定,p EGFPIP重组质粒构建成功。重组质粒转染48 h后,部分原代胎猪胰腺细胞强表达绿色荧光,而PIMSCs则不表达。诱导2周后,部分PIMSCs表达绿色荧光,同时随着绿色荧光的表达增强,其胰岛素表达也相应增强。说明成功构建出了猪胰岛素启动子-绿色荧光蛋白报告系统,该报告系统具有表达特异性,可用于检测由PIMSCs诱导分化得到的胰岛素分泌细胞。 相似文献