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斯氏副柔线虫CAMK/TSSK蛋白激酶基因的克隆及其蛋白质结构与抗原表位预测分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为分析并预测斯氏副柔线虫免疫相关基因CTPK编码蛋白结构、功能以及其作为疫苗候选抗原的可能性,通过提取斯氏副柔线虫组织RNA,反转录合成cDNA,设计特异性引物以扩增CTPK基因的CDS区,并利用生物信息学软件对CTPK进行蛋白质结构分析和抗原表位预测。生物信息学分析表明,CTPK基因cDNA序列全长共519bp,具有完整的开放阅读框(519bp),编码173个氨基酸,相对分子质量和等电点大小分别为20.264ku和9.53。结构分析发现,蛋白质无跨膜区,无规则卷曲构成二级结构的主要组分,亲水性氨基酸比例超过60%;抗原表位预测表明,CTPK蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,既含有较多潜在的B细胞抗原表位又存在较多的T细胞抗原表位。推测CTPK有望用作斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原,本研究为骆驼斯氏副柔线虫生前诊断方法iELISA的建立和DNA疫苗的研究奠定了理论基础。 相似文献
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本试验旨在构建原核表达载体pET30a(+)-NCC,对斯氏副柔线虫NCC基因特性进行生物信息学分析。应用RT-PCR技术扩增斯氏副柔线虫NCC基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),利用生物信息学软件对序列结构与抗原表位进行分析。结果显示,NCC基因全长711bp,编码237个氨基酸,蛋白质理论大小值为25.252ku,理论等电点为6.33,蛋白质不稳定指数为40.08;跨膜结构和信号肽分析表明NCC蛋白存在1个跨膜区,无信号肽区域,其磷酸化位点分布位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上。NCC蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,既含有较多潜在的B细胞抗原表位又存在较多的T细胞抗原表位,本试验为斯氏副柔线虫诊断方法的建立及免疫防控提供参考。 相似文献
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采用RT-PCR克隆斯氏副柔线虫CSY基因的CDS区,限制性内切酶对目的片段与pET30a(+)原核表达载体进行双酶切,构建重组表达载体,利用生物信息学软件对该基因理化性质、结构特点进行分析。结果显示:CSY基因全长774bp,编码255个氨基酸,蛋白质理论大小值为29 240,理论等电点为7.53,蛋白质不稳定指数为40.09;跨膜结构和信号肽分析表明CSY蛋白无跨膜区,无信号肽区域。结果表明:成功构建了pET-30a(+)-CSY重组表达载体;生物信息学分析表明CSY蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,可能有7个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位,有望用于斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。 相似文献
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试验旨在克隆斯氏副柔线虫糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原基因,并对其进行生物信息学分析。提取斯氏副柔线虫组织RNA,反转录合成cDNA,设计特异性引物以扩增GP基因CDS区,同时将其插入到克隆载体pMD19-T后测序,并对该基因编码蛋白的抗原表位、理化性质、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学预测。结果表明,GP基因开放阅读框(ORF)全长1 149bp,编码382个氨基酸,其分子式为C1760H2878N458O590S1760,理论分子质量约为40.15ku,等电点为4.37,无信号肽,总平均亲水性为0.032,不稳定系数为42.43,是疏水、不稳定蛋白;其磷酸化位点分布位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构分析显示,斯氏副柔线虫GP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主,与三级结构预测结果一致;抗原表位预测表明,GP蛋白可能有6个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位,有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。本研究成功克隆了斯氏副柔线虫GP基因,同时进行了系统的生物信息学分析和抗原表位预测,为斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立和DNA疫苗的研究提供理论依据。 相似文献
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斯氏副柔线虫GP基因的克隆、抗原表位预测及生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在克隆斯氏副柔线虫糖蛋白（glycoprotein，GP）抗原基因，并对其进行生物信息学分析。提取斯氏副柔线虫组织RNA，反转录合成cDNA，设计特异性引物以扩增GP基因CDS区，同时将其插入到克隆载体pMD19-T后测序，并对该基因编码蛋白的抗原表位、理化性质、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学预测。结果表明，GP基因开放阅读框（ORF）全长1 149 bp，编码382个氨基酸，其分子式为C1760H2878N458O590S1760，理论分子质量约为40.15 ku，等电点为4.37，无信号肽，总平均亲水性为0.032，不稳定系数为42.43，是疏水、不稳定蛋白；其磷酸化位点分布位于丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上；二级结构分析显示，斯氏副柔线虫GP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主，与三级结构预测结果一致；抗原表位预测表明，GP蛋白可能有6个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位，有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。本研究成功克隆了斯氏副柔线虫GP基因，同时进行了系统的生物信息学分析和抗原表位预测，为斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立和DNA疫苗的研究提供理论依据。 相似文献
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为建立骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法,本试验对骆驼斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶CPR基因进行重组表达,将获取的重组蛋白(rCPR)进行纯化和Western blotting检测,然后以纯化好的重组蛋白为抗原,通过棋盘滴定试验优化了抗原包被浓度、包被条件、抗体稀释度、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立了骆驼斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,并对建立的iELISA检测方法进行了重复性、敏感性、特异性试验和临床检测。结果显示,抗原最佳包被浓度为8μg/孔,血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶5 000,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭条件为3%BSA封闭2 h。临界值为0.235,待检血清D_(450 nm)值0.235则确定为阳性。重复性试验中变异系数均10%,重复性较好;用该方法检测阳性血清的敏感性为96.3%;此方法仅与骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清发生特异性反应,与感染了其他寄生虫的阳性血清无交叉反应,特异性为100%;对140份临床血清进行检测,阳性率为86.4%。综上可知,本试验成功建立了一种快速有效诊断骆驼斯氏副柔线虫病的iELISA方法。 相似文献
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为建立骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA （iELISA）诊断方法,本试验对骆驼斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶CPR基因进行重组表达,将获取的重组蛋白（rCPR）进行纯化和Western blotting检测,然后以纯化好的重组蛋白为抗原,通过棋盘滴定试验优化了抗原包被浓度、包被条件、抗体稀释度、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立了骆驼斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,并对建立的iELISA检测方法进行了重复性、敏感性、特异性试验和临床检测。结果显示,抗原最佳包被浓度为8 μg/孔,血清最佳稀释度为1：50,酶标二抗最佳稀释度为1：5 000,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭条件为3% BSA封闭2 h。临界值为0.235,待检血清D450 nm值>0.235则确定为阳性。重复性试验中变异系数均<10%,重复性较好;用该方法检测阳性血清的敏感性为96.3%;此方法仅与骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清发生特异性反应,与感染了其他寄生虫的阳性血清无交叉反应,特异性为100%;对140份临床血清进行检测,阳性率为86.4%。综上可知,本试验成功建立了一种快速有效诊断骆驼斯氏副柔线虫病的iELISA方法。 相似文献
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为研究斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)种间遗传标记特点,从内蒙古地区骆驼皱胃中采集斯氏副柔线虫成虫,提取虫体DNA,利用线虫通用引物扩增细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到pMD19-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落并进行测序,运用DNAStar 5.0和MEGA 4.0软件将测序结果与GenBank公布的相关线虫CO1序列进行比对分析。结果显示:斯氏副柔线虫DNA扩增出的CO1基因序列片段长度为689 bp。同其他相关属线虫CO1基因序列比对,斯氏副柔线虫与小口柔线虫(Habronema microstoma)、蝇柔线虫(Habronema muscae)的同源性最高,为86.7%,遗传距离为0.143;与加利西亚光丝虫(Litomosoides galizai)的同源性最低,为80.1%,遗传距离为0.229。通过两种不同方法建立的系统发育树比较,证实斯氏副柔线虫与柔线属线虫均位于同一分支,自展值都在47%以上。表明CO1基因不仅可以作为斯氏副柔线虫理想的种间遗传标记,也可为该线虫进一步的分子分类学研究提供重要基础。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2017,(5)
为了研制一种可用于检测弓形虫的快速诊断胶体金免疫层析试纸条,本研究对弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)SAG1和SAG2的基因片段进行重构合成,与PET-28a(+)载体连接后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,获得SAG重组表位抗原,Western blot对重组蛋白免疫原性进行分析。用r SAG重组蛋白及r SPG分别划线,作为检测线和质控线,制作胶体金免疫层析试纸条,利用小鼠弓形虫阳性血清及小鼠阴性血清检验胶体金免疫层析试纸条检查效果。本研究成功表达纯化了SAG抗原表位的重组蛋白,且该重组蛋白具有较好的免疫原性。以此多抗原表位的重组蛋白作为检查抗原研制了胶体金免疫层析试纸条,能够快速检测弓形虫的阳性血清,为基层弓形虫病的快速诊断奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(4):671-675
为了系统了解斯氏副柔线虫的转录组特征并构建其转录组图谱,以不同发育阶段的斯氏副柔线虫为研究对象,应用Illumina Nextseq 500高通量测序技术平台对其进行转录组测序及生物信息学分析,结果每个样本均得到3GB的原始数据,经质量控制和拼接组装后,共获得128 454个Unigene,序列片段的平均长度与N50值分别为634和1 037bp;将Unigenes与COG,Nr,Trembl等数据库进行比对,结果表明有35 324个Unigene比对到COG数据库,根据蛋白种类大致分为25类;通过GO功能分类,5 227个Unigene映射到GO不同的功能节点上;通过KEGG pathways分析,共有13 424个Unigene参与了8 155个代谢通路。该研究结果为斯氏副柔线虫病的基础理论、诊断方法及防治研究奠定基础。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2017,(5)
为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与p ET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性,His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500 bp,PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符;重组蛋白为可溶性表达,大小约23 k Da;Western blot结果显示,重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。 相似文献
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流行性乙型脑炎病毒E蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快速检测流行性乙型脑炎病毒抗体的方法,本研究参照已发表的JEV基因组序列,应用RT-PCR扩增了长约1000bp的E基因片段,连接pET30a表达载体中,经诱导后获得了以包涵体形式表达的重组E蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明其具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测流行性乙型脑炎病毒抗体的E-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为JEV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和JEV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
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为建立一种快速的猪流行性腹泻病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因序列,RT-PCR扩增了长约1 300 bp的N基因片段,连接pET30a表达载体后获得了以可溶性形式表达的重组N蛋白.重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性.以该蛋白作为诊断抗原,建立检测PEDV抗体的PPA-ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和PEDV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法. 相似文献
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《中国兽医杂志》2018,(10)
为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa～403 aa、771 aa～784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达抗原表位融合蛋白,用纯化的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了BCoV抗原表位基因重组表达质粒,获得了融合蛋白的抗血清,Western-Blot检测显示,该抗血清可与BCoV的融合蛋白特异性结合。表明成功构建了BCoV抗原表位基因原核表达载体并获得了BCo V抗血清,本研究为BCoV诊断试剂盒的开发和BCoV多表位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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为了建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的RHDV基因序列,RT-PCR扩增了长约510bp的VP60基因片段,连接PGEX-4T-1表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组VP60蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为RHDV的快速诊断、免疫兔群抗体监测和实验兔等级检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
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猪瘟Erns基因在大肠杆菌中的高效表达 总被引：3，自引：0，他引：3
提取猪瘟病毒石门系强毒株的基因组RNA,用RT_PCR扩增其Erns基因的cDNA,将其克隆到原核表达载体pPROEXTMHTc中,然后转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,Erns基因获得高效表达。SDS_PAGE分析显示,表达的重组融合蛋白表现分子量约为31ku。Westernblot分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性。重组蛋白可用于制备诊断抗原,用于标记疫苗接种和野毒感染的鉴别诊断。 相似文献
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为获得副猪嗜血杆菌(HPS)黏附素基因的表达产物并对其进行免疫原性鉴定,本研究采用PCR技术扩增了HPS黏附素基因序列,将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接,得到表达重组质粒。通过EcoRⅤ和HindⅢ双酶切鉴定和测序确认正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析,获得了59.5ku的表达产物,与预期大小的黏附素蛋白分子量一致。经western blot检测,表达产物与HPS阳性血清反应,证明表达产物具有一定的免疫活性。提示本研究所表达的蛋白将有助于HPS的血清学诊断和疫苗的研发。 相似文献
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为获得可作为血清学诊断抗原的体外诱导表达ASFV VP73 结构蛋白,根据GenBank登录的ASFV 基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因克隆至pUC57载体中,设计1对引物,PCR扩增获得429 nt的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化进表达菌株BL21(DM3)中进行体外诱导表达,SDS PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性。结果显示,成功构建表达重组载体pGEX KG VP73,且诱导有效表达了41Ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的35％;Western blot分析表达该蛋白具有良好的表达活性。试验为建立无感染性、快速、敏感的血清学诊断方法奠定了一定基础。 相似文献