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猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：2，他引：1
应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株S基因5′端含有B、C抗原位点的片段。将该片段亚克隆至杆状病毒转移载体pMelBac B中。重组质粒经纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经4轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组病毒,最终实现了在昆虫细胞内的蛋白表达。经Dot-ELISA进行抗原性分析,结果表明重组蛋白具有抗原性。本研究猪传染性胃肠炎血清学诊断方法的建立提供了必要的物质基础。 相似文献
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猪传染性胃肠炎(TGE)是猪的一种急性、高度接触性传染病,各种年龄及品种的猪对本病均易感,其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100％.该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).TGEV S蛋白(或称E2蛋白)形成病毒粒子表面的突起,携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇.S蛋白含有4个抗原位点,从氨基末端开始依次定为C、B、D和A,4个抗原位点都位于S蛋白N端543个氨基酸残基之内[1-2].本试验在巴斯德毕赤酵母KM71中表达了TGEV S蛋白B、C抗原位点片段,为建立TGE血清学检测方法提供必要的物质基础. 相似文献
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为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(11)
为比较猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白含有的两个线性抗原表位(C和D)的抗原性,本研究采用Dot-ELISA方法对原核表达的S蛋白抗原C和D的两种线性表位重组蛋白进行了抗原性比较分析。结果表明,在等质量或等摩尔的条件下,含有抗原线性表位C的重组蛋白的抗原性弱于含有抗原线性表位D的重组蛋白。本研究为建立TGEV感染的血清学诊断方法,以及进一步研究抗原线性表位C和D的结构及功能奠定了基础。 相似文献
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本研究分别用巴斯德毕赤酵母、杆状病毒和大肠杆菌表达系统中表达的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株纤突蛋白(S)基因5'端含有B和C抗原位点的片段,利用Dot-ELISA方法对表达蛋白进行了抗原性比较分析,初步建立了以巴斯德毕赤酵母系统表达的重组蛋白为包被抗原的TGEV Dot-ELISA检测方法。结果表明:两种真核系统中表达的重组蛋白的抗原性相对更强。抗原最佳包被量为50 ng,抗体稀释度1∶100,最适封闭液为10 mg/L牛血清白蛋白,血清反应时间为60 min;酶标二抗的工作浓度为1∶1 000,反应时间为30 min,底物在室温显色时间为5 min。本研究建立的Dot-ELISA方法对猪呼吸道冠状病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清的检测结果均为阴性,特异性良好。与Svanova TGEV/PRCV抗体诊断试剂盒比较,此方法的特异性和符合率分别为90%和87%。 相似文献
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为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。 相似文献
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《畜牧与兽医》2016,(5):31-38
为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)血清抗体的间接ELISA方法,将TGEV的N基因片段克隆到p ET-28a载体中,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并对表达的蛋白进行Western-blot鉴定。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,最终建立了检测TGEV抗体的间接ELISA方法。该ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等5种病毒阳性血清不发生交叉反应,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性。本研究可为猪传染性胃肠炎的流行病学调查、诊断与防控奠定基础。 相似文献
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为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。 相似文献
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为了获得能够用于猪传染性胃肠炎(TGE)鉴别诊断的抗原蛋白,本研究以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)山东分离株SD-LY6核衣壳蛋白(N)基因为研究对象,对其进行引物设计并进行RT-PCR扩增,经克隆测序后对N蛋白基因序列进行分析;同时对N蛋白基因进行克隆,构建重组质粒pET-15b-TGEV-N,并进行IPTG诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western-blot进行检测。研究表明,TGEV SD-LY6株N蛋白基因序列高度保守,核苷酸以及氨基酸序列同源性均在97. 0%以上;获得了大小约为47 ku的纯化重组N蛋白,该重组N蛋白可以与猪传染性胃肠炎阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性,与无关血清样本无交叉反应,可以作为TGE的诊断抗原,为下一步高效快速诊断方法的研究提供坚实的基础。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
本研究以纯化的原核表达猪传染性胃肠炎病毒N蛋白为诊断抗原，建立了猪传染性胃肠炎病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法，将其命名为mTGE-ELISA。该抗原不与其他常见10种猪病的阳性血清发生交叉反应。批内和批间重复性试验的变异系数均小于15％；对仔猪免疫后不同时间的血清检测结果表明mTGE-ELISA与纯化病毒ELISA符合率达95．0％；mTGE-ELISA相对于VN试验的敏感性为96．3％、特异性为92．2％：现地试验中，mTGE-ELISA与Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit的符合率达87．0％，通过中和试验复核结果表明，mTGE-ELISA的假阳性低于Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit。本试验建立的mTGE-ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性，为免疫猪群抗体监测和TGE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒重组核蛋白的纯化与Dot—ELISA抗体检测方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
将重组猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因原核表达载体p^ProEXHTb转化的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达核蛋白，经过Ni-NTA柱的纯化，获得纯化核蛋白。以该蛋白制备抗原，建立了以TGEV N蛋白重组抗原的Dot-ELISA诊断技术，其抗原最适包被量为1μg，抗原预点膜在4℃可保存5周以上。本法快速简便，适合基层进行抗体检测。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原表位C的串联表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国预防兽医学报》2017,(11)
为比较含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗原表位C不同表位密度的重组蛋白的抗原性,本研究将抗原表位C的编码核酸序列进行串联,构建了重组表达质粒pET-(C_1C_2)_2~p ET-(C_1C_2)_6,并在原核表达系统中表达了重组蛋白。Western blot分析表明,表达的6种重组蛋白r-C_1C_2~r-(C_1C_2)_6均具有良好的抗原性。采用Dot-ELISA方法对各重组蛋白进行了抗原性比较分析。结果表明,含有12个表位肽的重组蛋白r-(C_1C_2)_6的抗原性强于其它重组蛋白。本研究制备的串联重组蛋白为建立TGE血清学诊断方法奠定了物质基础。 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(9)
旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白。受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素。根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分,亚克隆至杆状病毒pFastBac~(TM)Dual上,获得重组质粒,命名为pFBD-TGR。将该质粒转化DH10Bac感受态细胞中,筛选较大的白色菌落,获得重组杆状质粒Bacmid-TGR,转染至sf9细胞中进行拯救病毒,转染后5 d～7 d,收上清,传至第3代,应用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测sf9细胞上清,进行目的蛋白表达鉴定。结果显示,重组穿梭质粒Bacmid-TGR构建成功,Western blot结果证明,杆状病毒表达了TGEV-RBD蛋白且能与Strep tag抗体和抗猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光结果证明,成功地表达了TGEV-RBD蛋白,为进一步开展猪传染性胃肠炎病毒抗体研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
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巢式RT-PCR在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用 总被引：3，自引：0，他引：3
建立对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的巢式RT-PCR(RT-nested PCR)检测方法,为该病的诊断和流行病学调查提供更为可靠和敏感的手段。根据GenBank中收录的TGEV,纤突蛋白S基因的核酸序列设计了2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR、RT-nested PCR方法,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的RT-nested PCR诊断方法。试验结果成功扩增出长度为886 bp和690 bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。表明RT-nested PCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此法简单省时、灵敏性高。 相似文献
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猪传染性胃肠炎(TGE)是由传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的高度接触传染性疾病,以仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为临床特征.该病毒主要编码纤突蛋白(S)、膜结合蛋白(M)、核蛋白(N)和小膜蛋白(sM)4种结构蛋白[1-2].其中S蛋白是惟一能诱导机体产生中和抗体的结构蛋白[3].在S基因的近N端包含了4个主要的抗原决定位点A、B、C、D,其中诱导中和抗体产生的主要是A位点[4].此位点缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体[3].本试验利用原核表达的TGEV S基因A位点重组蛋白免疫小鼠制备单抗,旨在为建立TGEV准确快速的病原诊断,以及探索相关药物治疗效果研究奠定技术平台. 相似文献
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《畜牧与兽医》2020,(8)
试验旨在建立一种快速的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。采用PCR方法对PCV3 ORF2基因主要抗原区域进行扩增,并利用原核表达系统进行截短表达,以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:PCR扩增了片段大小为348 bp的ORF2基因主要抗原区域,PCR扩增产物克隆至pET-32a原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明具有良好的反应活性。以重组蛋白作为包被抗原建立了检测PCV3抗体的间接ELISA方法,对PCV3阳性血清的最低检出效价可达1∶20 480;用该方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见疫病阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于5%。应用该方法检测四川地区533份不同日龄临床猪血清样品,PCV3阳性感染率达14.82%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性,为我国商品化PCV3血清学抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
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《养殖与饲料．饲料世界》2015,(11)
为构建表达TGEV S基因AD片段的重组乳酸杆菌,根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的抗原决定簇AD片段的基因序列,设计引物,PCR扩增该片段,测序正确后利用穿梭质粒整合进益生乳酸菌中表达。结果显示,经过酶切、PCR和PAGE电泳鉴定重组的r S-AD基因在乳酸菌中得到了表达。所以,获得了表达TGEV S基因AD片段的重组乳酸杆菌。 相似文献