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用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术特异性地扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（简称Gal-1）～Gallinacin-13（简称Gal-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank中获得胡须鸡β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因的注册号为：DQ858311~ DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，其氨基酸的同源性均在96.5～100％之间。利用Clustalx软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果Gal-1与Gal-1（a）、3在同一分支上，Gal-4、5、8在同一分支上，Gal-2、12、13在同一分支上，Gal-6、7在同一分支，Gal-9、10在同一分支，Gal-11独在一分支上。同样用RT-PCR方法分析了胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布，结果发现:Gal-1/2/4/5/6/7/10的表达分布非常广泛，Gal-3/8/9/11/12/13的分布少。 相似文献
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用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1(Gal-1)～Gallinacin-13(Gal-13)共13个基因编码区全长片段.通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为:DQ858311～DQ858323.比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1(a)～Gal-13,Gal-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性.均在96.5%～100%之间.利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Gal-1、Gal-1(a)、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-12和Gal-13在同一大的分支上;Gal-9和Gal-10在同一分支;Gal-11独在一分支上.用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布,结果发现:Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal-10的表达分布非常广泛,Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12和Gal-13的分布少. 相似文献
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鸡β-防御素基因的克隆与结构分析 总被引：5，自引：1，他引：5
通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。 相似文献
4.
以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。 相似文献
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人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达 总被引：2，自引：2，他引：2
根据人β-防御素-3(hBD3)和植物甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列，按照细菌密码子的偏爱人工合成了7对末端具粘合位点的核苷酸序列。经连接和PCR扩增，使人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein的编码序列通过一段序列（含凝血酶切割位点涟接成为嵌合DNA。将其插入到pET30a的T7启动子之下，构建成了防御素和甜蛋白双价基因的表达载体pET30a-hBDs-Bra，在大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中诱导表达后，得到了与预计分子量相同的蛋白，约占总蛋白的30．5％，产量约为1．4～2．8mg/mL。 相似文献
6.
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系三大成员之一,被认为是纤维素糖化的限速酶。本研究克隆黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1),并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达分析。以GenBank上黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)序列为模板,设计特异性引物,从黑曲霉(Asperjillus niger)基因组DNA中扩增目的片段,通过SOE-PCR的方法将猪腮腺分泌蛋白信号肽序列sp和bgl1相连,成功构建分泌型真核表达载体pc6-sp-bgl1,利用脂质体介导法瞬时转染哺乳动物CHO细胞,通过RT-PCR和Western blot检测,最后通过DNS(dinitrosalicylic acid)法测定表达产物酶学活性。PCR扩增得到的目的序列与文献报道序列的相似性为91%,预测的蛋白氨基酸序列相似性为99%。RT-PCR和Western blot检测证明,外源基因bgl1在CHO细胞中得到表达;分泌到细胞培养上清中的重组蛋白对水杨素的水解活性为1.74U/mL,说明重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。本研究克隆得到黑曲霉bgl1基因并在哺乳动物CHO细胞中进行表达,为β-葡萄糖苷酶在单胃动物中的利用提供了基础研究资料。 相似文献
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枯草杆菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A33为材料，通过PCR技术从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列。经过克隆、测序及BLAST比对分析，证实该基因编码β-甘露聚糖酶，属于β-甘露聚糖酶家族中的一员。该基因已注册GenBank（GenBank注册号：DQ269473）。将该基因构建到大肠杆菌表达载体pET-32a并转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3），经过诱导获得了此酶的高效表达. 相似文献
8.
不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。 相似文献
9.
肉鸡H9N2亚型禽流感病毒全基因测序及遗传进化分析 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank登陆的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的全基因序列,设计11对引物,运用RT-PCR方法扩增A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)毒株8个基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。基因序列比较及遗传进化分析结果表明,所克隆的8个基因片段均有HJ毒株完整的开放阅读框（ORF）,其血凝素（HA）基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-PSKSSR*G-,为不连续的碱性氨基酸,符合低致病性AIV HA基因裂解位点的序列特征;与QA/HK/G1/97的进化关系较近,处在同一分支。其神经氨酸酶（NA）基因在63、64、65位点上有3个氨基酸（T、E、I）缺失,在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94（DK/HK/Y280/97）群系。核蛋白（NP）基因整合有同地分离的H5N1亚型流感病毒NP基因片段,进化关系较近。基质蛋白（M）基因与1999年香港感染儿童的两株流感病毒（HK/1073/99和HK/1074/99）进化关系属于同一分支。非结构蛋白（NS）基因与近年来分离的猪源H9N2亚型流感病毒进化关系相近,和1998年首次报道的猪源H9N2亚型流感病毒（SW/HK/9/98）处在同一进化分支。聚合酶蛋白（PA、PB2、PB1）中,PB1从33-47位存在15个连续碱基缺失,是首次报道该基因ORF内存在缺失,从遗传进化上和近年来分离的H5N1亚型流感病毒处在同一分支上;PA基因从遗传进化上和PB1基因类似;PB2基因与常见的流感病毒毒株的遗传进化关系较远,在相应的进化树另成分支。因此,A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。 相似文献
10.
β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫食道腺分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用.以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b(GenBank登录号为FJ430142).此cDNA全长序列为1 640 bp,包括1个1 443 bp的完整ORF,编码1含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量为50.89 kD,等电点pI为6.94.序列比对分析表明,含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBD Ⅱ).cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36、76、187和344bp,切割点符合5'-GT……AG-3'的规律.系统进化树分析表明,该基因与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测该基因可能来源于细菌的水平基因转移. 相似文献
11.
采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段（GenBank登录号：EF026001）。序列分析显示该片段包括长为1643bpβ-actin基因5＇端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bpβ-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第1个外显子和第1个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT box,TATA box和CArG box,分别位于转录起始位点上游的-92、-29和-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼（Tanichthys albonubes）的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明,在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。 相似文献
12.
SUPERMAN 类基因是植物生长发育中的重要转录因子。为了揭示苹果 SUPERMAN 类蛋白家族的生理基因功能,本研究以富士苹果(Malus domestica Borkh.cv. Fuji)为试材,利用 RT-PCR 方法和锚定PCR 方法克隆了 MdLIFa(GenBank 登录号 HM370493)和启动子序列,利用特异引物 PCR 方法克隆了苹果基因组中其余 11 个 SUPERMAN 类基因。12 个基因命名为 MdLIFa/MdLIFb (GenBank 登录号:HQ260429)、MdSUP1a (HQ418477)/MdSUP1b (HQ418478)、MdSUP4 (HQ418475)/MdSUP12 (HQ418476)、MdSUP5a (HQ418469)/MdSUP13b (HQ418470)、MdSUP9a (HQ418473)/MdSUP9b (HQ418474) 和 MdSUP5b(HQ418471)/MdSUP13a(HQ418472),分别位于 11/3、1/1、4/12、5/13、9/ 未知和 5/13 号染色体,每对基因间的同源性均在86%以上。通过基因枪法轰击洋葱(Allium cepa)表皮细胞,基因瞬时表达证明 MdLIFa 定位于细胞核内。MdLIFa 基因启动子序列中含有多个参与花粉发育、根特异性表达、与光诱导和 Dof 单锌指基因家族作用的调控元件等。系统进化分析表明,MdLIFa/b、MdSUP9a/9b 和 MdSUP5a/13b、以及MdSUP1a/b、MdSUP5b/MdSUP13a和 MdSUP4/12 分别聚类为一组,参与植株的形态建成和花器官发育。苹果 12 个 SUPERMAN 类基因成对高度同源,具有生物学功能的多样性,为深入的基因鉴定和遗传转化提供有用信息。 相似文献
13.
刘胜旺 《农业生物技术学报》2007,15(2)
抗菌肽为一类小分子的，含氨基酸残基少于100个的，具有广谱抗菌活性的多肽。禽抗菌肽属β-防御素，为防御素的一个亚类。目前，已从鸡、火鸡和驼鸟的血液、鸡与火鸡的上皮细胞、以及企鹅的胃内容物中分离到多种禽β-防御素。这类抗菌肽具有广谱抗菌活性，能抗包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及囊膜病毒在内的许多病原微生物。本文主要综述了该类抗菌肽的分子特征、抗菌机理与应用前景，以期对进一步开展相关研究提供参考。 相似文献
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甘薯肌醇-1-磷酸合成酶基因的克隆及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)新品系农大603是从感茎线虫(Ditylenchus destructor)病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。以农大603和徐薯18块根的mRNA为模板，根据植物抗线虫病基因NBS保守氨基酸序列设计引物，进行 RT-PCR分析，发现农大603的肌醇-1-磷酸合成酶(Myo inositol-1-phosphate synthase , MIPS)基因的表达量高于徐薯18。采用3'RACE技术扩增出MIPS基因的3'末端cDNA。根据植物MIPS基因 5'端一段保守的氨基酸序列设计兼并引物，并与3'端的特异引物组合，扩增出该基因的5'端cDNA序列。DNA序列比对表明，甘薯MIPS基因与大豆(Glycine max)、番茄(Lycopersicon esculentum )的MIPS基因同源性较高，分别达83.63 %和83.89 %。甘薯MIPS基因全长cDNA的克隆，有利于进一步研究该基因与抗甘薯茎线虫病的关系。 相似文献
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枯草芽孢杆菌ZJF-1AS ββ-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和表达 总被引：3，自引：0，他引：3
β-1，3．1，4-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响。但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性。而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性，且热稳定性优于麦芽内源酶。本研究对Bacillus subtilis mutant ZJF-1A5葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达，并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究。 相似文献
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本研究利用RT-PCR从马铃薯（Solanum tuberosum）茎段总RNA中扩增、克隆了一cDNA分子。该cDNA分子含有一长为1224bp的开放读框,可编码一含407个氨基酸残基的多肽、理论分子量为46.40kD、可能为亲水性的胞外酶。因其氨基酸序列同源于α-淀粉酶,故将该基因命名为amyA1（NCBI收录号：GQ406048.1）。采用半定量RT-PCR方法检测了amyA1基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析了amyA1密码子的偏好性,以期为选择适宜的表达系统提供依据;同时对amyA1的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行了预测。基于NCBI数据库中有物种代表性的29种α-淀粉酶基因序列构建了基因进化树。与NCBI收录的马铃薯α-淀粉酶基因（NCBI收录号：M79328.1）的核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20至第348范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13家族及亚家族相似的催化活性域（PF00128、SM00624）,第349至第407范围内的氨基酸残基含有α-淀粉酶C-末端β折叠区域（PF07821）。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的（β/α）8桶状结构以及其它几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,2个马铃薯α-淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦和玉米等单子叶植物的序列同源性较低。 相似文献
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Sox9基因是号陛别分化形成有关的重要基因之一。以黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）为研究材料，使用RT-PCR在脑、精巢和卵巢分离和克隆到了黄颡鱼Sox9基因，序列比对分析表明，脑和精巢Sox9基因序列一致，称Sox9al（GenBank accession No．AY684328），卵巢的则与其有差异称Sox9a2（GenBank accession No．AY684329）。Sox9al与Sox9a2的核苷酸相似性为77％，氨基酸的相似性为84％，可以认定是由两个基因表达的。和其它动物Sox9氨基酸序列的同源性分析表明：黄颡鱼Soxga1与其它动物Sox9的相似性在8l％，89％之间，平均在86％左右；黄颡鱼Sox9a2的相似性在76％～86％，平均在83％左右。系统树分析揭示了Sox9为单起源，遗传距离远近也与传统分类结果一致。使用RT-PCR对Sox9a1与Sox9a2在雌雄黄颡鱼前脑和性腺组织的表达检测结果显示，Sox9a1在雌雄鱼的前脑和性腺均有表达，但Sox9a2只在卵巢表达，说明该基因可能与雌性性别形成及卵巢发育具有调控作用。 相似文献
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应用LA-PCR的方法,从荷斯坦牛基因组中成功地扩增获得6.0 kb和1.78 kb两个基因片段,其中6.0 kb包括αs1-酪蛋白基因5′调控序列到第三内含子部分,1.78 kb包括αs1-酪蛋白基因第十二内含子到第十四内含子之间序列,作为打靶载体的同源臂;从新生儿血液基因组中扩增获得5.5 kb的血小板生成素（thrombopoietin,TPO）基因组序列,包括第一内含子部分序列到3′终止子后的序列。以水牛β-酪蛋白基因的5′调控区4.4 kb片段为启动子,以pLoxp质粒为打靶载体骨架,加上同源臂片段和目的基因TPO的片段,经多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定基因重组过程,最终建成长达25 kb的人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体,PCR和酶切分析表明载体构建正确,为研制定点整合荷斯坦牛乳腺生物反应器奠定了基础。 相似文献
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β-1,3-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响.但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性.而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性,且热稳定性优于麦芽内源酶.本研究对Bacillus subtilis mutant ZJF-1A5葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达,并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究. 相似文献