共查询到18条相似文献，搜索用时 15 毫秒
1.
以含新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因的重组质粒为模板,设计特异引物进行重叠-延伸PCR扩增获得F基因的抗原结构域基因片段Fa、Fb和Fa-l-Fb,经SalⅠ和NotⅠ酶切后,定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-Fa、pGEX-Fb和pGEX-Fa-l-Fb;用定点突变方法获得重组质粒pGEX-Fa-mut.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌经IPTG诱导、提取表达产物进行蛋白电泳和免疫印迹分析.结果表明:Fa-mut、Fb和Fa-l-Fb结构域基因均获得了融合表达,表达产物与NDV阳性血清具有免疫反应性;与pGEX-Fa-mut不同,pGEX-Fa重组质粒在大肠杆菌中未能表达,且转化菌在IPTG诱导过程中未见生长,提示未经突变的Fa片段可能为毒性蛋白.三维结构预测结果显示,目的蛋白片段中均保留F蛋白中原有相应的抗原表位. 相似文献
2.
新城疫病毒HN基因主要抗原位点区段的原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用生物软件对新城疫病毒GD/GM/03/Ch的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定169～267位氨基酸、318～405位氨基酸和448～571位氨基酸3个区域作为多肽表位候选区域.用含新城疫病毒HN基因的重组质粒为模板,设计引物通过PCR扩增获得HNa、HNb和HNc 3个抗原结构域基因片段,分别经双酶切定向克隆到原核表达载体pBT上进行表达,并构建了pBT-HNa-b-c串联重组质粒进行表达,经过SDS-PAGE和Western-blot分析,验证了表达产物具有反应原性. 相似文献
3.
犬瘟热病毒水貂株H与F蛋白基因原核表达重组质粒的构建及表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将克隆质粒pMD-18T-H和pMD-18T-F分别进行双酶切,获得纯化的H基因和F基因,在T4DNA连接酶的作用下,亚克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得原核重组质粒pET28a-H和pET28a-F.将原核重组质粒转化大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta2(DE3)中进行表达,SDS-PAGE结果显示H基因和F基因分别表达相对分子质量约为31 400和38 200的融合蛋白,Western-blot检测结果显示,表达蛋白均可与CDV标准阳性血清呈阳性反应,表明原核表达的CDV H蛋白和F蛋白在反应原性上具有与天然H蛋白和F蛋白同样的特性,可作为CDV诊断用抗原,为CDV的免疫预防研究奠定基础. 相似文献
4.
新城疫病毒xx08毒株血凝素-神经氨酸酶基因主要抗原区原核表达及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
利用基因工程技术构建新城疫病毒HN基因抗原表位集中区HNI175-K367基因片段(523-1101位)的重组表达质粒pET32-HNI175-K367。将该质粒转化大肠杆菌BL21(ED3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定表明,HNI175-K367蛋白得到高效表达,其分子量约为38kD。Western-blot分析证实,HNI175-K367蛋白与鸡新城疫病毒高免血清发生特异性反应,表明利用原核表达系统获得的重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
5.
为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V. 相似文献
6.
构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。 相似文献
7.
根据NDVLaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT—PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a（＋））原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导人BL21（ED3）感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS—PAGE和Westem—blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31．1kDa和27．9kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Westernblot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pET -F780和pET—F760并获得了高效表达,通过Westernblot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。 相似文献
8.
坏死梭杆菌白细胞毒素是坏死杆菌病的主要致病因子,白细胞毒素基因（lkt）是其编码基因。以分离到的国内牛源坏死梭杆菌FN（A）菌株F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增白细胞毒素基因SH片段,克隆至pMD18-T载体上,以BamHⅠ和HindⅢ酶切的目的片段SH与相应酶切的pET32a载体连接构建pET32a-SH重组表达质粒,经转化E coli BL21（DE3）后用IPTG进行蛋白诱导,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况。结果表明：扩增基因序列大小为1800bp,SDS-PAGE检测重组蛋白有效表达,表达得到大小为80.2kDa的目的蛋白,采用镍柱亲和层析方法纯化SH重组蛋白,获得了纯度达95%的重组蛋白;经West-ern-blot证实,该蛋白对抗坏死杆菌阳性血清具有反应活性。 相似文献
9.
提取猪带绦虫激活和未激活六钩蚴总RNA,RT-PCR扩增HSP目的基因,将目的基因与pGH克隆载体连接,经酶切鉴定后,将阳性重组质粒进行测序,结果扩增出激活的六钩蚴的目的片段。将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-28a-HSP中,并将获得的pET28a-HSP阳性重组子转化至宿主菌E.coliBL21,IPTG进行诱导表达,并对重组抗原pET-28a-HSP进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果表明重组经SDS-PAGE分析可见一条约35 kDa大小的融合蛋白条带的抗原,Western-blot结果显示其能被囊虫病人阳性血清识别。这将为进一步阐明六钩蚴入侵中间宿主的机理、设计新型抗猪囊虫病和绦虫病疫苗打下基础。 相似文献
10.
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计2对引物,通过PCR扩增得到了PRRSV M基因的全长片段和N-末端截短67个氨基酸序列的MNd67基因片段,分别将这些片段插入到表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点上构建重组表达质粒,PCR、酶切及测序鉴定表明,成功构建了2种重组表达质粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖诱导其表达,SDS-PAGE电泳分析表明,E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV MNd67成功表达分子质量为14ku的重组蛋白,而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的表达蛋白。试验结果表明已成功表达截短的PRRSV M蛋白,可为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定基础。 相似文献
11.
根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F、HN基因序列和真核细胞表达载体pEGPF-N1的克隆位点,分别设计一对引物,通过PCR方法获得了F、HN基因,经回收纯化,将产物连接到克隆载体pMD18-T上。酶切鉴定和序列分析后,再将目的基因亚克隆到真核细胞表达载体pEGPF-N1上,经鉴定,成功构建含有NDVF和HN基因的真核细胞表达载体pEGPF-N1-F和pEGPF-N1-HN,为下一步研究NDVF和HN蛋白在细胞凋亡中的生物学功能奠定基础。 相似文献
12.
【目的】对新城疫病毒(NDV)HN09-69株P基因进行克隆、序列分析和表达鉴定,为研究P和V蛋白的功能,及NDV新流行毒株的免疫预防提供理论依据。【方法】以HN09-69株NDV为研究对象,根据GenBank上发布的相关P基因参考序列设计引物,进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析,将P基因的核苷酸序列与相关参考株的P基因序列进行比对分析并构建进化树。将P基因克隆到原核表达载体PET28a(+)中,得到重组质粒rPET28a(+)-P,将重组表达质粒转化到BL21（DE3）中诱导表达,用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测表达情况。【结果】扩增出了HN09-69株P基因的ORF,序列长度为1 188 bp。NDV HN09-69株核苷酸与弱毒株La Sota、clone-30同源性分别为82.5%和82.4%,与强毒株F48E8同源性为84.9%,与鸭源,鹅源NDV核苷酸同源性分别为97.9%～98.4%和96.0%～98.0%。SDS-PAGE电泳和Western blotting检测结果表明,重组P蛋白分子质量约为54 ku,符合预期结果,在大肠杆菌中主要以可溶性的形式表达。【结论】NDV HN09-69株与SDWF-02和SD-09鸭源强毒分离株同源性高,亲缘关系近。重组P蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献
13.
根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。 相似文献
14.
根据GenBank公布的标准Lasota株的HN基因序列,设计了一对引物,经RT-PCR从标准Lasota疫苗毒中特异性扩增出约1590bp的HN基因。将扩增得到的基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-NDV/HN,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌BL21(pET-NDV/HN)。将重组菌诱导表达后,通过SDS-PAGE分析可见约64.3kDa的特异条带,说明融合蛋白大小与预期理论值相符;Western blotting结果进一步表明表达的蛋白可与NDV阳性血清发生特异性结合,说明其具有良好的免疫原性。 相似文献
15.
根据已发表的新城疫病毒 (NDV)的核苷酸序列设计了 5对引物 ,采用RT PCR技术 ,分别扩增新城疫病毒长春株基因组中的F、HN、M、P及NP基因 ,并克隆和测定序列。与新城疫弱毒LaSota株和V4株进行同源性比较 ,并对NDV长春株、LaSota株及F48E9株F蛋白分子结构的疏水性及抗原表位分析 ,表明NDV长春株具有新城疫病毒弱毒株的特性。 相似文献
16.
[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性. 相似文献
17.
18.
[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。 相似文献