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为优化南林95杨叶片遗传转化体系,以南林95杨叶片为外植体,采用均匀设计U12(12×63),利用组织化学染色定位法,根据GUS基因的瞬时表达量,研究了农杆菌浸染时间、农杆菌菌液OD600值、共培养时间、乙酰丁香酮浓度等4个因素对遗传转化的影响。建立相关的线性回归方程,并优化了南林95杨叶片的农杆菌介导遗传转化体系,即农杆菌浸染时间35 min、农杆菌OD600值1.1、共培养时间4 d。 相似文献
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尾赤桉DH201-2遗传转化体系建立的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以建立的尾赤桉(Eucalyptus urophylla × E. camaldulensis)DH201-2无性系高频再生体系为基础,利用GUS染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、农杆菌预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对尾赤桉茎段和叶片外植体遗传转化的影响,探讨了适宜尾赤桉转化的卡那霉素和抑菌抗生素头孢塞污钠的使用浓度.结果表明,较优的转化条件是:采用农杆菌菌株GV3101,以茎段为受体材料,经过预培养6 d,在光密度OD600=0.5的菌液中浸泡30 min,然后转移到共培养培养基中共培养4 d,再转移到含90 mg/L卡那霉素和300 mg/L头孢噻肟钠的筛选培养基上,进行转化植株的再生,同时在共培养培养基和菌液中添加100 μM的乙酰丁香酮能够提高茎段外植体的转化效率. 相似文献
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对农杆菌LBA4404转化柚木愈伤组织的适宜条件进行了优化．结果表明;LBA4404转化柚木愈伤组织的适宜预培养时间为11～15d,菌液光密度为0．5～0．8,共培养时间为13d,共培养的pH为5．6～6．2;重新悬浮的作用明显,乙酰丁香酮的作用不明显;不同无性系对LBA4404侵染的敏感性不一样,选择适宜的无性系可显著提高转化效率． 相似文献
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不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料,研究6个影响杉木遗传转化效果的因素,初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为:预培养1～3 d,OD600 nm为0.1～0.4的菌液浸染10～15 min,共培养3～5 d,共培养基附加乙酰丁香酮(AS)80 μmol·L-1,共培养后延迟3 d筛选.在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素(Km)抗性芽,在二次筛选培养基上获得39个Km抗性芽.PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性,初步证明外源天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因已整合到这2个Km抗性芽的基因组DNA中. 相似文献
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通过预培养时间、菌液稀释倍数、浸染时间、共培养时间、抗生素质量浓度5因素4水平的正交实验,得出优化组合,认为组培苗叶片外植体预培养5 d,菌液稀释45倍,浸染4 min,共培养3 d,然后转入含500 mg/L羧苄青霉素的1/2M S培养基上培养,金银花的发根诱导率最高,达54.3%.随机抽取离体培养的发根经PCR检测,证实为转化发状根. 相似文献
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国槐遗传转化体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
采用根癌农杆菌介导的国槐叶盘转化法,在建立修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)转化体系过程中,对影响农杆菌转化频率的各种因素进行研究.结果表明:国槐叶片需在黑暗条件下在MS培养基上预培养5天,农杆菌菌株选用GV3101,农杆菌共培养3天较合适;农杆菌菌液浓度OD600约为0.7,感染时间10 min;侵染前的菌液和共培养基中添加200/μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)对国槐遗传转化有明显的促进作用;抑制农杆菌生长的抗生素浓度以头孢霉素(Cef)500mg·L-1最好.PCR和Southern blotting检测证实sck基因已整合到国槐基因组中. 相似文献
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[目的]建立稳定的食线虫真菌淡紫紫孢菌遗传转化体系，并获得插入突变体。[方法]介导的方法，以淡紫紫孢菌20-7的分生孢子为受体，将新构建的携带beta tubulin基因的质粒转化进入淡紫紫孢菌的细胞中，通过优化诱导乙酰丁香酮(AS)的浓度、诱导培养时间、农杆菌终浓度OD660值、共培养AS的浓度、共培养时间和共培养温度等因子，建立高效遗传转化体系，获得致病力不同的突变体。[结果]共培养过程中使用萌发孢子是成功建立淡紫紫孢菌遗传转化体系的必要条件；淡紫紫孢菌萌发的孢子与农杆菌EHA105在25℃共振荡培养48 h时，且在共培养阶段当乙酰丁香酮浓度为200μg·mL-1(pH5.5)时转化效率最高，转化效率为1 200～3 200个转化子/106分生孢子，阳性抗性转化子比率为96%；转化子PCR表明，T-DNA已整合到淡紫紫孢菌的基因组中；Southern杂交验证表明，83.3%的转化子为T-DNA单拷贝插入；成功建立了可靠的淡紫紫孢菌的遗传转化体系，并从20个转化子中筛选到16个致病力变异的突变体。[结论]本研究成功构建... 相似文献
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本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、茵液浓度、As浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素的适宜浓度。运用DPS软件对试验结果进行分析,建立了杨树遗传转化体系。结果表明：外植体预培养7d,在含As200μmol／L的茵液浓度为0．6的农杆菌液中侵染20rain,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg／L;本试验共获得6株转化植株,经GUS染色检测和PCR分析表明．GUS基因已初步整合进入南林95杨基因组中。 相似文献
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《林业科学》2021,(8)
【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。 相似文献
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进行扶芳藤下胚轴抗生素敏感性试验,筛选出适合其抗性芽筛选的抗生素为G418(40mg·L-1)。建立农杆菌介导的扶芳藤遗传转化体系,确定适宜农杆菌转化的菌液浓度(OD600)、浸染时间(min)和共培养时间(hr)分别为:0.5、30和48。 相似文献
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四倍体刺槐转甜菜碱醛脱氢酶基因的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
试验以所建立的四倍体刺槐高频再生体系为基础,通过农杆菌介导法转化甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因,以GUS染色组织分析法为依据探讨了影响转化效率的各种因素,建立了优化转化体系,结果如下:20mg·L~(-1)乙酞丁香酮可显著提高转化效率;菌液浓度OD_(600)值0.3～0.7、预培养2d为宜;转化后暗培养对转化效率没有影响。并在以上研究基础上,成功地建立了高效、可重复的遗传转化体系,选择培养基上头孢霉素400mg·L~(-1)可有效地抑制农杆菌;卡那霉素50mg·L~(-1)时愈伤组织的白化死亡率达96.4％。经PCR检测,外源基因已成功的整合到植株的基因组DNA中,获得了15个转基因株系。 相似文献
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利用农杆菌介导法获得转codA基因麻竹再生植株的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
温度是影响植物生存和生长发育的基本环境因子之一。大多数植物对低温等都是高度敏感的,低温伤害现象尤为突出,几乎涉及所有的经济植物。因此,改善植物的抗低温冻害的胁迫能力,可以显著提高植物的生长范围、增加产量。codA基因可以增加植物对低温胁迫的耐受能力,而Rd29A是一种胁迫诱导特异表达启动子,胁迫条件可以快速诱导基因表达,也可以减少由于转基因过量表达带来的不利影响。研究以麻竹花药离体培养的愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法,探讨了影响麻竹愈伤组织遗传转化效率的主要因子。结果表明,潮霉素的最佳筛选浓度是25 mg.L-1,预培养时间为3 d,侵染时间为20 min,共培养时间为3 d,乙酰丁香酮的浓度控制在100 mg.L-1时可以有效的提高遗传转化效率。在此基础上对获得的转基因植株进行分子检测,初步表明外源基因codA已经整合到麻竹基因组中。 相似文献
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以烟草无菌苗叶片为外植体,利用叶盘法,将含生长素应答基因(auxin response factor,ARF)的根癌农杆菌LBA4404携带双元质粒载体(pBin438)介导进行遗传转化.结果表明:诱导烟草叶片不定芽的最佳分化培养基为MS 0.8 mg.L-16-BA 0.05mg.L-1NAA,生根培养基为1/2MS 0.02 mg.L-1IBA 0.02 mg.L-1NAA,分化率、生根率分别为96.9%、96.7%;将预培养3 d的外植体与农杆菌菌液浸染3~5 min后,共培养2~3 d,然后转化到含Km75 mg.L-1的选择培养基上进行分化筛选,再转入Km为75 mg.L-1、100 mg.L-1的培养基上进行生根筛选,生根率为66.1%;与对照相比,转基因烟草在形态上发生了明显的改变,叶片颜色变深绿,叶片增厚,主叶脉变粗壮等.PCR扩增,获得40株阳性转基因苗,证明ARF基因已导入烟草中. 相似文献
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农杆菌介导慈竹4CL基因遗传转化梁山慈竹 总被引：4，自引：0，他引：4
以梁山慈竹2种类型成熟胚的愈伤组织为材料,采用农杆菌遗传介导的方法,将已构建好的具有降低木质素含量的PBI121-4CL-RNAi表达载体导入愈伤组织,探讨愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和温度对遗传转化的影响。研究结果表明,淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织是较好的遗传转化材料。以在愈伤组织培养基上预培养8天的淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织为转化受体,在菌液浓度为OD600=0.05的EHA105中侵染20min后,在25℃、黑暗条件下共培养2天(共培养基表面加一层无菌滤纸),在含有卡那霉素为55mg.L-1的抗性筛选培养基上筛选30天,抗性愈伤组织率为90%,经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹愈伤组织中。抗性愈伤组织在芽诱导培养基上诱导30天,可获得丛生芽,待丛生芽长至3～5cm后,在生根培养基上经过20～30天的诱导,可产生1～8条根,获得再生植株。经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹再生植株中,获得了转基因植株,转化效率为9%。RT-PCR检测结果表明,转4CL基因的梁山慈竹愈伤组织和植株的内源4CL基因的表达受到抑制,且表达量比对照明显降低。 相似文献
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为实现杨树早期开花,缩短育种周期,利用农杆菌介导的转化方法,探讨影响热激启动子控制的FT1基因转化白杨派杂种无性系的因素,优化其转化条件,并实现FT1基因的转化,采用热激诱导方法诱导2～3个月大的转基因植株早期开花。结果表明:叶盘转化前的预培养、菌液浓度、侵染时间及共培养时间对卡那霉素抗性植株再生率的影响均达到极显著水平;叶盘在愈伤组织诱导培养基上暗培养6天,然后用活化至OD600=0.5的菌液侵染60min,再在愈伤组织诱导培养基上共培养2天,该条件下FT1基因转化白杨派杂种的卡那霉素抗性植株再生率可达29.84%;37℃每天1h持续热激3周可使FT1基因顺利表达,促进转基因植株开花;热激植株大小是影响转基因植株热激诱导开花的限制因素,低于20cm的植株不能诱导开花;热激诱导可产生相对较多的正常花器,但花器变异仍然十分广泛。 相似文献
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利用农杆菌介导法将与植物纤维素合成有关的纤维素合成酶基因导入喜树体内,并对影响遗传转化效率的几个因子进行了研究,建立了有效的喜树遗传转化体系。采用预培养的外植体在OD600(0.5)的农杆菌菌液中侵染10分钟,外植体与农杆菌侵染后在再生培养基上与农杆菌共培养三天,然后转入筛选培养基,获得了最佳的转化效率。Southern杂交结果证明UGPase基因已经整合到喜树的基因组中。在最佳的转化条件下获得了 6%的转化效率。这个转化系统对于利用遗传转化对喜树进行遗传改良是非常有意义的。 相似文献
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农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。 相似文献