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鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
以鸡大肠杆菌Wwl株(O78，OMP-3．Amp^R，K^5)和WD2株(O2，OMP-1，Amp^5．K^R)作为亲本菌株，采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体，以PEG作为助溶剂，进行原生质体融合，得到4株双耐药融合菌株，融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性，且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3，OMP-1)和O抗原(O78，O2)．表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。 相似文献
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以鸡大肠杆菌Ww1株(O78,OMP-3,AmpR,KS)和WD2株(O2,OMP-1,AmpS,KR)作为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体,以PEG作为助溶剂,进行原生质体融合,得到4株双耐药融合菌株,融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性,且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3,OMP-1)和O抗原(O78,O2),表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。 相似文献
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禽大肠埃希氏菌融合菌株疫苗的研制及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
对从陕西省主要养鸡地区病死鸡分离的禽致病性大肠埃希氏菌进行Omp分型，用不同Omp型的菌株构建成融合菌株。用融合菌株制作铝胶灭活疫苗，与单价疫苗和两亲本菌株双价疫苗的免疫保护效果进行比较。结果表明，融合菌株疫苗可对多种O血清型致病性大肠埃希氏菌的攻毒试验产生坚强的保护，保护率高达93％～100％，而O血清型单价疫苗的保护率仅67％～80％，双价疫苗的保护率仅80％。在生产中对蛋用鸡的应用结果表明，融合菌株疫苗可明显降低鸡的死淘率。 相似文献
4.
以耐药标记的鸭疫里默氏杆菌TXRA1(Chlr,Erys)和大肠杆菌ZBO78(Eryr,Chls)作为亲本菌株,在DnaseⅠ始终存在的条件下,采用Lysozyme-EDTA法制备2菌株的原生质体,原生质体制备率分别达到了92.00%和91.94%,再生率分别达到了38.77%和37.29%。通过PEG法进行2菌株原生质体融合,成功获得31株具有双亲本耐药性(Chlr,Eryr)的融合菌株,并应用双重PCR方法对融合株的部分外膜蛋白A(ompA)基因进行扩增,其中有11株融合菌株能够表达2亲本的ompA基因,有20株仅表达亲本大肠杆菌的ompA基因。融合菌株的形态、染色特性和生化特性等介于2亲本菌株之间,连续传15代后融合菌株的上述性状仍能够稳定遗传。 相似文献
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为查明辽宁地区猪源大肠埃希菌磺胺类耐药菌株中sul1、sul2及dfrA1 3种基因型的流行及分布情况,科学指导兽医临床合理用药,为猪大肠埃希菌病的防控提供科学依据,利用PCR技术对磺胺类耐药菌株进行了3种耐药基因型的检测。通过对耐药基因的检测发现,27株磺胺类耐药菌株中sul2的检出率最高,为74.07%(20/27);其次为sul1、dfrA1,检出率分别为33.33%(9/27)、22.22%(6/27),同时携带sul1、sul2和sul2、dfrA1两种基因型的菌株均占11.11%(3/27),同时携带sul1、sul2及dfrA1 3种基因型的菌株占14.81%(4/27)。表明辽宁地区猪源大肠埃希菌磺胺类耐药菌株中sul2为主要流行的基因型,并且在辽宁不同地区普遍存在,是介导猪源大肠埃希菌对磺胺类药物耐药性的主要基因型,其次为sul1、dfrA1。 相似文献
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布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。 相似文献
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为查明辽宁地区猪源大肠埃希菌氯霉素类耐药菌株主要耐药基因的流行及分布情况,为猪大肠埃希菌病的防控提供科学依据,采用聚合酶链反应(PCR)对25株氯霉素类耐药菌株进行cat1、cmlA基因检测,并对cat1和cmlA基因进行序列分析。通过对耐药基因的检测发现,cat1、cmlA基因的检出率分别为32%和84%,8株同时检出cat1和cmlA基因。因此,在辽宁地区cmlA基因在猪源大肠埃希菌耐药菌株中普遍存在,cmlA介导的泵出机制是辽宁地区氯霉素类抗生素产生耐药性的主要原因;其次为cat1基因,与氯霉素乙酰转移酶的灭活有关。 相似文献
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禽多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌科间原生质体融合的研究 总被引：8，自引：0，他引：8
以耐药标记的华农系禽多杀性巴氏杆菌５：Ａ弱毒菌株与禽大肠杆菌Ｏ２弱毒菌株作亲本，在ＤＮａｓｅ１始终存在的条件下，采用溶菌酶－ＥＤＴＡ法制备两亲本菌株原生质体后再生，原生质体形成率均９０％以上，原生质体再生率为３５．６３％，５０．９３％。通过聚乙二醇－钙离子促融合剂系统，进行质体后再生，原生质体融合，成功地获得３株具有双亲本耐药性和双菌体血清型的融合菌株。 相似文献
10.
《中国兽医杂志》2014,(7)
本研究旨在调查四川和重庆地区仔猪源大肠埃希菌的耐药性及血清型流行状况。本试验采用玻片凝集法和纸片扩散法对采自两地不同区域的43个猪场共273株大肠埃希菌进行血清型鉴定和耐药性测定,结果表明,273株大肠埃希菌分属43个血清型,优势血清型由高及低依次为O138、O20、O8、O60、O141、O7、O38,合占检出菌株的46.83%(96/205);对14种药物存在不同程度的耐药性:对氨苄西林、磺胺嘧啶、四环素呈高度耐药,耐药率均在90%以上,较为敏感的丁胺卡那霉素、头孢他啶敏感率分别为53.11%、49.45%,大部分菌株呈多重耐药,共151种耐药谱型。由此可见,川渝地区部分规模化猪场大肠埃希菌的流行血清型多、耐药程度严重。故掌握优势血清型,筛选有效抗菌药物,采取对应措施防治大肠杆菌病已势在必行。 相似文献
11.
克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。 相似文献
12.
获得高纯度具有生物学活性的重组布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,并进行抗原性的分析。将用PCR扩增出的布鲁菌Omp10、Omp25基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32α中,构建pET-32α-Omp10/Omp25原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21（DE3）PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化,分别用Western-blot和间接ELISA检测产物的抗原性。基因测序及酶切鉴定证明pET-32α-Omp10/Omp25原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明,Omp10、Omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达。经过包涵体的变性、复性及亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 000和44 000的融合蛋白,与预测的相对蛋白分子质量一致。Western和间接ELISA试验证明纯化的Omp10、Omp25融合蛋白能被免疫的牛布鲁菌阳性血清所识别。结果表明,成功获得了布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,且均具有一定的免疫原性,通过血清学反应证实,Omp10、Omp25蛋白为布鲁菌病临床诊断试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
13.
本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b（Omp2b）基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041 bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38 ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。 相似文献
14.
根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础. 相似文献
15.
《中国兽医学报》2019,(2):260-264
为提高布鲁菌疫苗株的免疫保护效果,本试验以牛布鲁菌疫苗株S19为研究对象,将羊布鲁菌Omp31基因克隆、扩增并插入至广宿主质粒pBBR1MCS-2中,构建重组质粒pBBR1MCS-Omp31;通过电转化的方式转入S19感受态细胞中,经抗性基因筛选和PCR验证,获得重组牛布鲁菌S19-Omp31株;该重组菌株连续传25代未发现重组质粒和Omp31基因丢失,表明其遗传稳定性良好;进一步经SDS-PAGE检测可见约26 000相对分子质量的目的条带,采用Western blot法检测显示目的蛋白可与His单克隆抗体及Omp31蛋白高免血清反应。本研究构建的重组牛布鲁菌S19-Omp31株能够稳定表达目的基因,为进一步开展S19-Omp31株的免疫效果评价奠定基础。 相似文献
16.
克隆羊外膜蛋白Omp25基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对Omp25蛋白的抗原性进行分析.以布鲁氏菌染色体DNA模板,扩增Omp25基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠杆菌ER2566 (DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blotting鉴定Omp25蛋白的免疫原性.将Omp25克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中.将重组质粒转化于大肠杆菌ER2566 (DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 000的融合蛋白.Western blotting分析表明,所表达的蛋白具有免疫原性.结果表明,成功地表达并纯化了Omp25蛋白,而且纯化的蛋白具有一定的免疫原性.本试验为进一步研究Omp25蛋白的功能以及寻找布鲁氏菌的诊断性蛋白奠定了基础. 相似文献
17.
克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。 相似文献
18.
为了对多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(OmpH)的免疫学活性进行鉴定,本研究根据已发表的Pm70株序列(AE004439)设计了两对引物,用PCR方法扩增了鸭多杀性巴氏杆菌C48-102株的Omp H,扩增片段为1180bp(ORF为1056bp)。Omp H与GenBank中登录的C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D的序列比对结果表明:Omp H在核苷酸水平上同源性为82.8%～99.2%;在氨基酸水平上同源性为82.1%～99.1%。扩增去信号肽的Omp H基因,构建了原核重组表达质粒pHT-Omp H,转化BL21并诱导表达,SDS-PAGE结果表明:表达蛋白约为41ku,与预期的分子量大小相符;western blot结果表明具有良好的免疫学活性,这为以重组OmpH蛋白建立针对鸭Pm的血清学检测方法奠定了基础。 相似文献
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重组布鲁菌外膜蛋白Omp的制备方法及免疫原性研究 《畜牧与饲料科学》2022,43(3):1-7
[目的]探索重组布鲁菌Omp19蛋白的制备方法,评价其在实验动物中的免疫原性,为中试工艺放大奠定基础。[方法]利用摇瓶培养对重组Omp19蛋白进行原核诱导表达,对培养基类型、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间、诱导时的菌体密度等条件进行筛选;利用阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析对重组Omp19蛋白进行纯化制备;利用SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）对重组Omp19蛋白的纯度进行鉴定;利用动物实验评价制备的重组Omp19蛋白的免疫原性。[结果]摇瓶培养试验表明,重组布鲁菌Omp19蛋白较优的表达条件为：使用LB培养基,在菌密度OD600 nm值为0.6~1.0时加入0.5 mmol/L的IPTG,于28 ℃诱导5 h;经3步纯化后,获得了高纯度的重组Omp19蛋白;免疫原性研究表明,经方法优化后制备的重组Omp19蛋白联合佐剂可以较好地刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体。[结论]优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法,评价了其在小鼠中的免疫原性,为重组布鲁菌疫苗的研发提供了实验基础。 相似文献