共查询到20条相似文献，搜索用时 78 毫秒
1.
[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
2.
以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)为IFN-β诱导剂,将猪瘟病毒(Classical swine fever vires,CSFV)E0基因的C末端与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protem,EGFP)基因相连,瞬时表达于猪。肾细胞PK15中,利用荧光素酶报告基因系统检测IFN-β启动子的活化状态,结果显示CSFV E0蛋白可抑制NDV对IFN-β启动子的诱导作用,抑制效应随E0蛋白量增加而增强;半定量RT-PCR结果显示,E0蛋白可明显降低IFN-βmRNA的生成量。结果表明,E0蛋白具有干扰素拮抗功能。该研究为阐明CSFV的致病及持续感染机制提供了理论支持。 相似文献
3.
利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移栽体pFastBacHT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3～4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白. 相似文献
4.
利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白. 相似文献
5.
【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 相似文献
6.
为建立一种经济、可靠的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,采用间接ELISA(E0-ELISA)方法,以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组蛋白E0为包被原,优化反应条件。结果显示,优化后的E0-ELISA在包被原1.0μg/mL质量浓度下37℃包被1 h效果最佳,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉溶液37℃作用2 h,待检血清以1∶100稀释后37℃作用60 min效果最佳,二抗以1∶5 000稀释后37℃孵育45 min效果最佳。当OD_(450)0.370时,判断为猪血清CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为1.99%～7.69%和2.16%～9.23%,表明该方法具有良好的稳定性;E0-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清时结果均为阴性;当CSFV阳性血清稀释至1∶640时结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性;与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E0-ELISA检测符合率为92.00%,敏感性为97.86%,特异性为78.33%。综上,成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法。 相似文献
7.
利用针对猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CsFV)石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制. 相似文献
8.
【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。 相似文献
9.
利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。 相似文献
10.
为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌,一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFVE0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中,将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性,用Ad-hisE0感染293A细胞,实时定量PCR检测显示E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺,SDS-PAGE和Western blot分析结果显示出E0蛋白分别位于26ku和48ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。 相似文献
11.
目的 建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。方法 选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。结果 三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 μL-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。结论 本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。 相似文献
12.
[目的]探究甘蔗杂交种子对甘蔗花叶病毒、高粱花叶病及黄叶病的传播性,为甘蔗抗病育种提供参考.[方法]采集父本或母本感染花叶病或黄叶病的甘蔗杂交种子样品10份,分别以SCMV、SrMV和SCYLV特异性引物进行一步法RT-PCR扩增、克隆和测序分析.对田间实生苗进行生物学观察,并采用RT-PCR检测其叶片SCMV、SrMV和SCYLV携带性.[结果]经特异性引物检测,10份杂交种子中仅有样品H4显示SrMV阳性,扩增的特异片段大小为828 bp,其核苷酸序列与GenBank中已报道的SrMV基因序列同源性达99％.聚类分析结果表明,样品H4的SrMV和GenBank中SrMV外壳蛋白序列的自举水平达100％,证实H4样本感染的病毒为SrMV.田间连续45 d观察均未发现出现病毒症的甘蔗幼苗;经RT-PCR检测,均未在10个样品实生苗叶片中发现此3种病毒.[结论]甘蔗种子可携带高粱花叶病(SrMV),但未能通过种子传播至实生苗. 相似文献
13.
黑龙江省分蘖洋葱病毒病原的初步鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
黑龙江省分蘖洋葱病毒病发生普遍 ,阿城、宾县、五常的发病率均为 10 0 % ,病情指数分别为6 2 .13% ,71.0 7%和 4 9.87%。典型症状为黄化条纹花叶 ,叶片扭曲畸形、叶尖干枯 ,植株矮缩 ,鳞茎退化变小 ,产量和品质大幅度下降。被分蘖洋葱病毒系统感染的有洋葱、大葱、大蒜和蚕豆 ,局部感染的有千日红、苋色藜。电镜观察表明 ,病体细胞中含有大量线状病毒粒体 ,长度在 30 0～ 14 5 0 nm。通过叶片超薄切片 ,在叶肉细胞质中观察到大量的风轮状、束状、涡轮状和环状内含体 ,叶绿体被破坏。体外抗性测定结果表明 ,致死温度为 5 5～ 6 5℃ ,稀释限点为 10 - 4,体外保毒期为 3d。酶联免疫测试和洋葱黄矮病毒抗血清、韭葱黄条纹病毒抗血清、大蒜复合病毒抗血清呈阳性反应。以上特征证明 ,黑龙江省分蘖洋葱病毒病为几种病毒复合侵染 ,初步鉴定为洋葱黄矮病毒和韭葱黄条纹病毒。 相似文献
14.
[目的]明确引起广西蔗区甘蔗花叶病的病原,为甘蔗抗花叶病育种、种质筛选及病害防控提供科学依据.[方法]从广西主要蔗区采集不同品种显症或不显症甘蔗叶片,提取RNA后采用甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮化病毒(MDMV)和约翰逊草花叶病毒(JGMV)特异引物进行一步法RT-PCR检测,将目的片段克隆并测序;病毒CP基因序列在GenBank数据库中进行比对分析.[结果]在收集的48份样品中检测出SrMV阳性33份,SCMV阳性2份,SCMV和SrMV复合侵染1份,未检测到MDMV和JGMV.花叶病的发病率为75.0％,其中,SrMV、SCMV及两种病毒复合侵染的发病率分别为68.8％、4.2％和2.1％.台糖系列及其他引进品种的甘蔗花叶病感病率较高,桂糖系列品种的感病率相对较低.[结论]甘蔗花叶病已在广西大部分蔗区发生,其致病原以SrMV为主,SCMV零星发生,由SCMV和SrMV复合侵染的甘蔗花叶病发生机率较低.广西蔗区可能存在其他种类病原病毒引起的甘蔗花叶病. 相似文献
15.
病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点 ,是当今最有发展前景的疫苗研究领域之一。试验将已构建的表达牛流行热病毒 (BEFV)结构糖蛋白 G基因的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )转移载体 pd TK - L ac Z-G,通过脂质体方法转染由牛传染性鼻气管炎病毒 Bartha毒株感染的 MDBK细胞 ,筛选出形成蓝色蚀斑的重组病毒 ,并对其进行蚀斑纯化。通过 PCR方法鉴定该重组病毒证明基因组中含有完整的牛流行热病毒 G蛋白基因 ,实验为开发 BEFV/ IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
16.
黑龙江省大蒜病毒病的田间症状复杂,研究通过生物学技术、电子显微镜技术和血清学方法相结合对大蒜病毒病原进行鉴定,并对黑龙江省大蒜病毒病的发生情况进行了调查。结果表明,表现花叶症状的大蒜样品中含有韭葱黄条病毒(Leek yellow strape virus,LYSV)和大蒜潜隐病毒(Garlic latent virus,GarLV);表现黄化症状的大蒜样品中含有洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)和大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latentvirus,GCLV);表现卷叶症状的大蒜样品中含有GCLV、LYSV和OYDV。黑龙江省大蒜病毒病的发生相当严重,且多数为复合侵染,其中LYSV、GCLV和GarLV的检出率较高。 相似文献
17.
利用重组PCR技术将香蕉束顶病毒的复制酶基因和黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白基因融合重组,并与植物表达载体pBI121连接,构建了抗香蕉束顶病和香蕉花叶病的双价植物表达载体,通过冻融法转化载体人根癌农杆菌LBA4404,获得了工程农杆菌pBI121．FBC,从而为培育抗病转基因香蕉品种奠定了基础． 相似文献
18.
随着信息社会的发展,通过计算机网络获取信息的方武也越来越普及,而且在各行各业发挥着至关重要的作用.因此,网络病毒的防治正成为计算机防毒领域的研究重点.本文首先指出网络病毒的概念,提出了目前常用的几种网络防病毒的重要技术和方法. 相似文献
19.
20.
分别从陕西咸阳、兴平、杨凌、柔谷、眉县、岐山、凤翔等地采集辣椒病毒病标样126份,在室内通过单斑分离及回接验证得到5种分离物,采用鉴别寄主的生物学反应和DA S-EL ISA法鉴定,结果表明,引起陕西辣椒病毒病的毒原有黄瓜花叶病毒(CM V)、烟草花叶病毒(TM V)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和蚕豆萎蔫病毒(BBW V),其中CM V和TM V是优势毒原种群,分别占检测样品的60.31%和30.94%。在室内分别以CM V和TM V的枯斑寄主苋色藜和心叶烟为测试寄主,采用半叶法对接种叶片分别于接种前和接种后涂施病毒抑制剂,测试了7种病毒抑制剂的抑制效果。结果表明,接种前后涂施3.85%病毒必克水乳剂500倍液,均对黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒有很好的防治效果,且接种前涂施的防治效果较接种后涂施的防治效果好。 相似文献