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根据已发表的天蚕素B的cDNA序列化学合成4务引物,以重叠延伸PCR的方法合成了真核细胞偏爱密码子编码的抗菌肽天蚕素B基因,将其克隆于pMD18-T栽体,DNA序列分析证实合成的抗菌肽基因的碱基序列与设计的序列完全一致.利用山羊-β酪蛋白基因5'侧翼调控序列和真核基因表达栽体plRES1-neo,构建抗菌肽天蚕素B的乳腺组织特异性表达载体pbCP-cpin,将该载体溶于生理盐水,注入处于泌乳期的成年母山羊乳腺组织进行暂时表达.通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌试验确定了抗菌肽天蚕素B基因在山羊乳腺中的表达和抗菌活性.本试验建立了抗菌肽天蚕素B的乳腺瞬时表达系统,为验证各调控元件以及抗菌肽基因在转基因动物乳汁中分泌表达的有效性和可行性提供了一个快速检测系统. 相似文献
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采用高效热不对称交互式PCR(hiTAIL-PCR)的方法,取转基因克隆猪血液,提取基因组作为模板,扩增目的片段,将扩增获得的特异性产物,连接到PGEM-T载体上,送测序公司测序.测序结果与载体序列经比对后,获得侧翼序列.将获得的侧翼序列提交GenBank与猪的基因组数据库比对确定了在基因组上的位置.结果表明目标序列整合到猪的15号染色体的基因组克隆(nw_00188566P4)中.该方法可以有效、快捷的鉴定外源基因在基因组中的整合的具体位置,具有良好的应用前景. 相似文献
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根据已经发表的牛气管抗菌肤(bTAP)cDNA序列设计4条短的寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR的方法合成bTAP基因,将其克隆至pMD-18T载体,序列测定正确后,构建bTAP基因的乳腺组织特异性表达载体pBcp-bTAP,将其溶于生理盐水后直接注射山羊乳腺小叶,使bTAP基因在乳腺组织内表达,收集注射质粒前后的奶样,测试奶样对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的抑制能力,结果显示注射pBcp-bTAP后的奶样表现出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用,这种抑制活性可以持续至20h以上. 相似文献
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摘要：为了研究天蚕抗菌肽在奶牛乳腺组织较长期表达的可行性及对天蚕抗菌肽对大肠杆菌的抑制作用,将天蚕抗菌肽B(cecropin B,CB)的基因序列,以哺乳动物偏爱的密码子优化后,设计合成了四条相互重叠的DNA片段,通过重叠延伸PCR法合成了天蚕抗菌肽B的基因,亚克隆至T载体,测序正确后构建逆转录病毒载体pLNCX-bCP-cecB,经过包装细胞的包装,获得含有天蚕抗菌肽B表达框的逆转录病毒,注射入奶牛乳腺组织,通过琼脂板孔穴扩散法检测基因的表达及活性;实验结果表明,克隆的抗菌肽基因在乳腺中获得了表达,表达产物对大肠杆菌具有抑制作用,抑制效果可以持续至13天以上。 相似文献
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逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖 总被引：2，自引：0，他引：2
摘要:利用针对猪瘟病毒（Classical swine fever virus , CSFV）石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株。以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆的进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro 基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）侵染Marc145过程中HSP27和Annexin A2蛋白可参与病毒粒子的组装过程,且HSP27可起到抑制侵染早期细胞凋亡,增加病毒复制时间的作用。本研究分别构建HSP27和Annexin A2下调的Marc145细胞系,经PRRSV感染后发现,与空白对照相比,两者子代病毒TCID50值有明显下降。这一结果为研究PRRSV侵染过程及HSP27和Annexin A2调控机制奠定了基础,也为疫苗的研制提供了新的思路。 相似文献
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根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。 相似文献
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为研究猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,将原核表达菌种MSTN-PGEX-4T-1-BL21进行融合表达,用亲和层析的方法对GST-MSTN和MSTN C-端成熟蛋白进行分离纯化。12%SDS-PAGE结果表明,纯化后的GST-MSTN在38 kD得到清晰目的带,薄层扫描分析显示,目的蛋白质纯度达86.1%。每升菌液提取约4.5 mg融合蛋白。15%SDS-PAGE结果表明,MSTN C-端成熟蛋白功能区在12 kD有明显条带出现。每升菌液提出约1.3 mg MSNT C-端成熟蛋白,占融合蛋白表达量的29%。 相似文献
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猪MSTN基因敲除载体的构建及细胞筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
构建猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因的打靶载体并获得敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞.以Puro为正筛选基因,白喉毒素-A(DT-A)为负筛选基因.将同源长臂和同源短臂分别插入Puro基因的两侧.同源长短臂分别为4 294 bp和1 015 bp,定点敲除MSTN基因的部分内含子2和部分外显子3.采用FugeneHD 转染法将打靶载体转入37 d的猪胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用嘌呤霉素筛选.结果显示,成功构建了对猪MSTN基因部分区域进行敲除的打靶载体,共得到48个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,获得2个正确同源重组的细胞克隆. 相似文献