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1.
水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。 相似文献
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针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。 相似文献
3.
针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。 相似文献
4.
构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。 相似文献
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试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1 (zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036 bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48 h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1 shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1 shRNA1276 (77.8%和67.0%,P < 0.05)。 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(1)
为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1)的shRNA慢病毒表达载体,设计出SynDIG1的siRNA的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,合成的Oligo经过退火分别与双酶切处理后的pLKO.1-GFP载体连接。将构建的重组质粒pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA转化到DH5α感受态细菌中,过夜培养后挑选阳性克隆子,扩增后提取DNA进行质粒测序,得到两个序列正确的重组质粒。用这些重组质粒转染HEK293T细胞以及大鼠海马神经元细胞,蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光检测SynDIG1 shRNA对外源性和内源性SynDIG1表达的敲减作用。进一步用重组质粒转染HEK293T细胞产生慢病毒颗粒,用病毒颗粒感染DIV2和DIV14的神经细胞,免疫印迹检测SynDIG1的表达。结果表明这两个重组质粒均能够有效地抑制外源性和内源性SynDIG1的表达,对HEK293T中瞬时表达的SynDIG1敲减率达到75%,其慢病毒颗粒感染对早期神经细胞中内源性SynDIG1的表达抑制也很明显。用pLKO.1-GFP成功构建了能够有效抑制外源性和内源性SynDIG1表达的重组质粒,为探讨RNA干扰技术抑制神经细胞SynDIG1基因表达的相关研究奠定基础,为研究SynDIG1基因在神经传导和突触发育及其可塑性调节中的作用提供了有力工具。 相似文献
7.
UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2016,(2):70-73
为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。 相似文献
10.
《家畜生态学报》2021,(6)
为了建立稳定干扰牛β-连环蛋白的牛肾细胞(MDBK)系,针对牛β-连环蛋白基因的mRNA设计3对shRNA引物序列,分别构建shRNA慢病毒干扰载体;将牛β-连环蛋白过表达载体和shRNA载体共转染293T细胞,检测shRNA的沉默效率;将筛选有效干扰β-连环蛋白的shRNA载体进行慢病毒包装,并利用包装好的重组慢病毒感染MDBK细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得单细胞克隆,传代培养后检测β-连环蛋白的表达,获得有效沉默牛β-连环蛋白的稳定细胞系。结果表明,成功构建了牛β-连环蛋白干扰载体pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3,均较好地沉默了β-连环蛋白的表达,经嘌呤霉素筛选和Western blot检测获得有效沉默β-连环蛋白的MDBK细胞系。该研究通过β-连环蛋白特异性shRNA慢病毒载体构建了稳定干扰牛β-连环蛋白的MDBK细胞系,为进一步探讨牛β-连环蛋白与病毒的相互作用及其分子机制奠定基础。 相似文献
11.
为探索干扰素诱导跨膜蛋白1（interferon-inducible transmembrane protein 1,IFITM1）对猪源冠状病毒复制的影响,本研究选用猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）高致病毒株及其宿主细胞PK15作为研究对象。正常PK15细胞接种TGEV后,实时荧光定量PCR检测感染后不同时间点PK15细胞中一些干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes,ISGs）的mRNA表达水平;利用慢病毒表达系统构建稳定表达和稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系。将一段靶向干扰猪源IFITM1的shRNA序列及猪源IFITM1全长,分别插入pLKO.1-EGFP-Puro载体及pLVML-Myc-MCS-IRES-Puro载体中,分别构建出pLKO.1-IFITM1shRNA-EGFP-Puro及pLVML-Myc-IFITM1-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞后获得带有目的基因的重组慢病毒,慢病毒侵染PK15细胞后用嘌呤霉素进行筛选,获得稳定表达及稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系,分别命名为PK15-IFITM1及PK15-IFITM1-/-,并分别用实时荧光定量PCR、间接免疫荧光试验（IFA）及Western blotting检测IFITM1干扰效率及表达情况;TGEV接种PK15-IFITM1-/-和PK15-IFITM1,实时荧光定量PCR测定细胞中TGEV的拷贝数。结果显示,PK15细胞接种TGEV后的48 h内,一些ISGs的mRNA水平均有所上升;PK15-IFITM1-/-细胞系的干扰效率为70%,PK15-IFITM1细胞系表达成功;在PK15-IFITM1-/-细胞系中,IFITM1的mRNA水平显著下调,促进了TGEV的复制。反之,在PK15-IFITM1细胞系中,TGEV的复制受到了抑制。但IFITM1的表达或缺失却不影响TGEV对PK15的吸附作用。总之,IFITM1对TGEV有显著的抗病毒作用,IFITM1不影响TGEV对PK15细胞的早期吸附,这为后续IFITM1抗冠状病毒机制的研究奠定了基础。 相似文献
12.
构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×105 TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。 相似文献
13.
试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1 404 bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P<0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P<0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P<0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。 相似文献
14.
为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征.本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib.将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞.Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染Vero E6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位.该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础. 相似文献
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利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系，分析稳转细胞系的自噬水平和活力，为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体，转染至293T细胞，获得慢病毒颗粒，将病毒颗粒感染B16F10细胞，通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果，Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况，CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明，成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA，纯化的慢病毒滴度为1×108 TU·mL-1，建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制，mRNA的沉默效率约为75%（P<0.01），发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量，降低B16F10细胞活力。以上结果表明，干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性，促进B16F10细胞死亡，这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。 相似文献
16.
研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。 相似文献
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Dassanayake RP Lawrence PK Knowles DP Davis WC Foreyt WJ Srikumaran S 《Veterinary immunology and immunopathology》2011,141(1-2):84-91
Leukotoxin (Lkt) and LPS are the major virulence determinants of Mannheimia haemolytica that contribute to the pathogenesis of bovine and ovine pneumonic pasteurellosis. We have previously identified bovine and ovine CD18 as the functional receptor for Lkt. LPS complexes with Lkt resulting in increased thermal stability and enhanced cytotoxic activity of Lkt. Cellular recognition of LPS involves several different molecules including CD14. We hypothesized that expression of ovine CD14 together with LFA-1 or Mac-1 would enhance Lkt-induced cytotoxicity. Ovine cDNA for CD14 was amplified by PCR and cloned into mammalian expression vectors. The 1122 bp cDNAs for bighorn sheep (BHS) and domestic sheep (DS) CD14 encode 373 amino acids which exhibit 99% identity with each other. Ovine CD14 plasmids were transfected either into HEK-293 cells, or previous HEK-293 transfectants stably expressing ovine LFA-1 or Mac-1. Flow cytometric analysis of transfectants confirmed the cell surface expression of CD14. The transfectants expressing LFA-1 or Mac-1 and the transfectants co-expressing CD14 with LFA-1 or Mac-1 did not show any significant difference in Lkt-induced cytotoxicity when incubated with LPS complexed Lkt. In contrast, incubation of the LFA-1 or Mac-1 and LFA-1/CD14 or Mac-1/CD14 transfectants with Lkt which lacks LPS, resulted in reduced cytotoxicity. None of the above transfectants showed any difference in [Ca2+](i) elevation when incubated with both types of Lkt preparations. Lkt did not induce any cytotoxicity or [Ca2+](i) elevation in ovine CD14 transfectants or parent HEK-293 cells. Based on these findings, we conclude that expression of CD14 together with LFA-1 or Mac-1 does not enhance Lkt-induced cytotoxicity, whereas LPS enhances cytotoxicity by complexing with Lkt. 相似文献