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新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性. 相似文献
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为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。 相似文献
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为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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根据梅花鹿正常朊蛋白基因序列设计特异引物,采用PCR方法扩增出梅花鹿正常朊蛋白特异性基因片段PRNP(67～699),将该基因克隆至pGEX-6p-1载体中,构建pGEX-6p-1-PRNP原核表达质粒.将重组质粒转化至Rosetta-gami(DE3)受体菌中,IPTG(1.0 mmol/L)37℃诱导培养4 h,经SDSPAGE和Western-blotting鉴定,结果表明目的蛋白获得高效表达.通过GST-Resin Kit纯化,得到质量浓度为417.8 mg/L的蛋白,并具有抗原性. 相似文献
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用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增，得到了1条完整的基因，大小为642bp；测序分析证明，它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析，表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，用IPTG进行诱导。结果证实，该基因可以在大肠杆菌中表达，表达产物为分子质量约50ku的融合蛋白，与理论推测的蛋白分子质量一致；Western—blotting试验证明，表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。 相似文献
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为获得Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)融合蛋白(fusion protein, F蛋白)和O18型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜基因A(outer-membrane proteases, OmpA)嵌合蛋白和双特异性抗体，试验首先采用基因合成技术获得Ⅶ型NDV F基因和O18型APEC的OmpA基因片段，使用同源重组技术将F基因插入到OmpA基因中，再将重组基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建嵌合表达质粒，对重组质粒中的插入基因序列进行测序鉴定；将序列正确的嵌合表达质粒转入大肠杆菌BL21(Rosetta)感受态细胞中，利用IPTG诱导嵌合蛋白表达，使用SDS-PAGE和Western-blot检验嵌合蛋白的表达情况；纯化嵌合蛋白后免疫兔获得抗血清，抗血清再经抗原亲和纯化层析柱纯化获得多克隆抗体，采用间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定抗体效价。结果表明：成功合成了Fo和OmpA1、OmpA... 相似文献
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猪雌激素受体α基因E区部分cDNA克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：1
采用逆转录PCR（RT-PCR）法从梅山猪子宫组织中扩增雌激素受体α（ERα）基因E区部分cDNA编码区546bp，并将其重组于谷胱甘肽转移酶（GST）融合表达质粒pGEX-6p-1中，经酶切、序列鉴定分析后，用该重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生GST-ERαE融合蛋白，分子量约为49ku，净灰度扫描融合蛋白占重组菌蛋白32％，结果表明成功构建GST—ERαE融合蛋白表达载体，并获得高效表达，为下阶段深入开展ERα蛋白功能研究打下了良好的基础。 相似文献
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根据Wood 46株金黄色葡萄球菌a溶血素(a-HL)基因序列设计了引物，用高保真PCR从1800株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了0．9kb的a-HL基因，序列测定结果显示，两菌株a-HL基因的核苷酸序列有6个碱基差异，但仅引起1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏茵外膜蛋白A信号肽序列与a-HL编码区融合，并将其第130～134位氨基酸替换为5个连续的组氨酸，获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入pET-30a质粒，用获得的重组质粒pET-H5转化感受态大肠埃希氏菌，获得分泌性表达H5的重组茵。经IPTG诱导后，重组菌表达出分子质量为35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为180ng／mL，能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性，且能被Zn^2 抑制。提示，表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白，能用作真核细胞内玻璃态保存的渗透剂。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体，利用RT-PCR方法从TGEV TH98株中扩增出M蛋白基因，并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上，转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）pLysS，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明，从TGETH-98株克隆到了M基因cDNA，该基因全长789bp，与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92．37％、98．35％、99．87％和96．96％。SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒获得了约57ku的目的带，其中M蛋白的分子质量约为31ku，与预期的结果一致；Western-blotting分析表明，融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实，TGEV的M基因高度保守，构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板，PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc)，酶切及核苷酸序列分析鉴定后，与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接，构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc，转入大肠杆菌B121中，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析发现，转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD，与实际预测相符，命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明：纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。 相似文献
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布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。 相似文献
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牛瑟氏泰勒虫P23和P33表面蛋白双基因融合表达载体的构建及原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为探索牛瑟氏泰勒虫的表面蛋白基因融合产物作为双价疫苗的可行性,以牛瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应（SOE-PCR）把P23和P33表面蛋白基因连接一起,2个基因之间插入一个linker（Gly4Ser）3,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得1151bp的双基因融合片段,克隆于表达质粒pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-P23-P33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小70．0ku的融合蛋白。Western blot检测结果显示,该蛋白与牛瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据。 相似文献
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为在大肠杆菌中高效表达镰形扇头蜱免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin binding protein,IGBP),并对表达产物进行免疫保护效果测定,将IGBP基因克隆到pGEX-4T-1载体,转化到感受态细胞BL21,在IPTG诱导下进行表达;表达产物3次免疫家兔,剂量为500μg/只。3次免疫后进行攻蜱试验,观察免疫保护效果。结果发现在IPTG的诱导下,重组质粒pGEX-4T-1-IGBP在大肠杆菌中获得高效表达,产生GST-IGBP融合蛋白,用融和蛋白免疫家兔后,试验组与对照组成蜱饱血重量和死亡率差异显著(P<0.05)。表明重组质粒pGEX-4T-1-IGBP能在大肠杆菌中高效表达,且表达蛋白能够对家兔产生一定程度的抗蜱保护性免疫力。 相似文献
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犬干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
依据IFNα1和THYα1的分子结构特征设计了1个连接肽,根据氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,采用PCR方法合成了三者融合基因,将该基因克隆至pGEX4T-2载体中,构建了pGEX4T-2-IFNα1-THYα1原核表达质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)受体菌中,37℃培养至D600为0.6~1.0时,IPTG(1.0 mmol/L)诱导培养4 h,经SDS-PEGA和Western-blot鉴定,目的蛋白获得高效表达。 相似文献
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应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒（CDV）核衣壳（N）蛋白基因的高度保守序列，将其克隆至质粒pMD18-T中，获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株，经IPTG诱导，N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western—blot分析结果显示，表达产物的分子质量为55ku，与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明，大肠杆菌表达的CDVN蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性，可作为诊断用抗原。 相似文献
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利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV3ABC基因，将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SaⅡ酶消化后，克隆到表达载体pGEX-6p-1上，构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）pLysS，经终浓度1mmol／L的IPTG诱导，获得约70ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示，表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GsT-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较，表明，融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。 相似文献
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PCR扩增单增李斯特氏菌ActA基因,纯化后克隆到pMD 18T simple vector 中,以BamHI和EcoRI双酶切克隆载体pMD-18T/ActA,再将其亚克隆到表达载体pGEX-3X中,获得重组质粒 pGEX-3X/ActA,转化E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导融合蛋白(GST-ActA)表达,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应.试验采用Glutathione Sepharose 4B亲合层析纯化融合蛋白.对单增李斯特氏菌ActA的原垓表达与纯化的研究为单增李斯特氏菌诊断试剂的研制及Acth的免疫原性研究奠定了基础. 相似文献