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将A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)的NP基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有NP基因的表达盒(CMV+NP+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失处,获得含有NP基因表达盒的穿梭载体pVAXΔE3-NP。用SalⅠ+NruⅠ分别对pVAXΔE3-NP和pPoly-2-CAV-2进行双酶切,将含有NP基因表达盒的片段定向克隆入pPoly-2-CAV-2,获得在E3区缺失处插入NP基因表达盒的重组质粒pCAV-2-NP。释放CAV-2-NP重组基因组,脂质体介导转染DK细胞,获得了能使DK细胞产生典型腺病毒样细胞病变的CAV-2-NP重组病毒。从形态学、基因组水平、NP基因的转录、NP蛋白的表达以及重组病毒的生长特征等方面进行鉴定。结果表明,CAV-2-NP具有典型的CAV-2形态特征,在繁殖过程中没有对H5N1NP表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录H5N1NP基因的mRNA,ELISA和免疫荧光分析表明重组表达产物可被流感病毒NP基因单克隆抗体1G6G4所识别。 相似文献
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感染性犬2型腺病毒全基因组克隆及鉴定 总被引：13，自引：1，他引：12
以犬 2型腺病毒 (canine adenovirus type- 2 ,CAV- 2 )自然弱毒株 YCA18基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增分别获得其双链两末端 10 13bp(U)和 972 bp(D)的 DNA序列 ,以首尾相接方式克隆入载体 p Poly2 ,获得重组质粒p Poly2 - UD。以 Hind 和 Bst B 双酶切 p Poly2 - UD,回收含载体和部分 U、D的大片段并与 CAV- 2 DNA共转化感受态 E.coli Sure TM,经菌体内同源重组 ,获得含有 CAV- 2全基因组序列的重组质粒 p Poly2 - CAV- 2。后者以 Cla 和 Asc 双酶切 ,释放 CAV- 2全基因组 ,通过脂质体介导转染 MDCK细胞 ,盲传 3代后重复转染 1次 ,4d后 ,出现腺病毒典型病变。细胞上清血凝效价为 1∶ 6 40 ,并可被 CAV- 2抗血清有效抑制。以上结果表明 ,本研究获得了具有感染性的CAV- 2全基因组重组质粒 ,为以 CAV- 2作为重组疫苗载体的系列研究奠定了重要基础。 相似文献
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应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因，继而构建出真核表达载体pVAX—VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上，筛选出VPl表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得转移载体。再经酶切，连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞，转染3次后，细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定，证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2／FMDV。经验证，该重组毒可稳定遗传，其毒价为10^3.5TCID50／mL。 相似文献
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表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5,经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因。经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达。体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性。本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为测定表达犬瘟热病毒(CDV)H基因的重组犬2型腺病毒(CAV-2/CDVLPH)免疫原性,25只45-50日龄犬(抗CDV中和抗体小于1∶2,CAV-2 HI抗体效价小于1∶2)随机分为5组进行免疫犬试验,第1组为CAV-2/CDVLPH免疫组,第2组为pVAXLPH免疫组,第3组为pVAXLPH和CAV-2/CDVLPH联合免疫组,CDV弱毒疫苗组和pVAX1空载体组分别作为阳性和阴性对照组。利用间接ELISA和CDV中和试验检测免疫犬的抗CDV体液免疫水平、CAV-2 HI试验检测免疫犬的抗CAV体液免疫水平、淋巴细胞转化试验检测免疫犬的抗CDV和抗CAV-2细胞免疫水平,分析CAV-2/CDVLPH的免疫性。结果,能够在各试验组免疫犬血清中检测到抗CDV ELISA抗体和抗CDV中和抗体,同时在第1组和第3组免疫犬的血清中检测到抗CAV-2的HI抗体,免疫犬的外周淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激均有明显增殖,第2组的免疫应答水平低于第3组,第1组又高于第3组,但低于CDV弱毒疫苗免疫组,试验表明CAV-2/CDVLPH可同时诱导免疫犬产生抗CDV和CAV特异性免疫,CAV-2/CDVLPH与pVAXLPH相比能诱导犬产生较高的特异性免疫应答,然而低于CDV弱毒疫苗。 相似文献
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为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立了同时扩增CDV(410 bp)、CPV(253 bp)、CVA-2(655 bp)和CPIV(868 bp)的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法,对CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠状病毒(CCV)的DNA或c DNA模板进行扩增,发现该方法的特异性良好。利用建立的多重PCR方法与单一PCR方法进行敏感性比较,发现两者敏感性相差10倍,证明多重PCR方法敏感性良好。利用该方法对从北京市采集的30份犬病料样品进行检测,发现CDV阳性率为63.33%(19/30)、CPV阳性率为33.33%(10/30)、CAV-2阳性率为6.66%(2/30)、CPIV阳性率为0(0/30)。检测结果证明建立的多重PCR方法可用于临床诊断。 相似文献
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根据犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬腺病毒2型(Canineadenovirus type2,CAV-2)GeneBank登陆的基因序列各设计一对引物,经试验条件优化,建立了检测CAV-2的PCR方法和CDV的RT-PCR方法,CAV-2可扩增1108bp片段、CDV可扩增560bp的目的片段,特异性试验表明建立的方法只能特异扩增CAV-2和CDV,不能扩增犬细小病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群、狂犬病病毒。敏感性试验表明,所建立的双重PCR方法可以扩增4.63ng总核酸量。在上述试验基础上继续优化条件建立了能同时检测CAV-2和CDV两种病毒的双重PCR检测方法,并用该方法检测来自辽宁、吉林等15家动物医院134份鼻液和眼眵样品,与商品化试纸条检测结果相比,本方法更加敏感和方便。研究结果表明,本实验建立的方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热病毒和犬腺病毒2型的快速检测和鉴别诊断。 相似文献
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为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。 相似文献
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犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病,流行范围广,发病率、致死率高,临床症状多样。CDV感染宿主广泛,所有日龄的犬都有可能感染。CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属,有囊膜包裹的单股负链线性RNA病毒。CDV基因组编码6种蛋白:核衣壳(N)蛋白、磷(P)蛋白、基质膜(M)蛋白、融合(F)蛋白、血凝素(H)蛋白和大(L)蛋白。N、P和L蛋白与病毒复制有关;M蛋白与病毒的装配和出芽有关;F、H蛋白在病毒的侵染过程中起到关键作用。近年来,随着我国宠物业、毛皮经济养殖业的迅速发展,CD在我国的发病率有升高的趋势。论文对CDV分子生物学研究进展进行归纳总结。 相似文献
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核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中与犬副流感(CPIV)同源性较近的SV5病毒N基因保守序列,利用DNAStar软件设计了一对特异性引物,能扩增265bp大小的片段,并以此建立了检测CPIV的RT-PCR方法,实验证明该对引物特异扩增CPIV;不扩增犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的四种病原的核酸。检测临床病料20份,其中2分为CPIV阳性。此法敏感性较高。是检测犬急性传染性呼吸道疾病(CIRD)中CPIV的有效的方法。 相似文献
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应用免疫金电子显微镜技术,研究了犬传染性肝炎病毒(ICHV)在犬肾传代细胞内的形态发生及抗原定位,发现ICHV除了在宿主细胞核内发生外,还有细胞质内发生途径.在细胞质内,病毒核壳体的装配以均质致密包涵体和副晶格包涵体为“基地”,这与细胞核内形态发生方式相似.免疫金标记显示,细胞质包涵体中含有大量的ICHV抗原成分,是核壳体在细胞质内装配的病毒结构蛋白来源.同时,在感染的细胞质内也观察到与细胞核内相同的病毒核心样结构. 相似文献
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A fatal case of hemorrhagic enteritis in a young dog is described. Hemagglutination and electron microscopic studies support a viral etiology. 相似文献
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犬瘟热,猫细小病毒,犬腺病毒弱毒株的理化特性及生物学试验 总被引：4，自引：2，他引：2
以鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）、猫肾传代细胞（ＣＲＦＫ）、狗肾传代细胞（ＭＤＣＫ）从引进的疫苗中分别分离到犬瘟热ＣＤＶ－Ａ株、猫细小病毒ＦＰＶ株、犬腺病毒ＣＡＶ１株。对三个弱毒株的细胞病变规律,形态特征,病毒滴度,理化特性,核酸型,血清学交叉反应,本动物的安全性及免疫原性等内容进行了试验。鉴定结果表明,３个弱毒株均可作为制苗用毒种 相似文献