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中国巴马小型猪封闭群内源性反转录病毒存在状况分析 总被引：4，自引：0，他引：4
检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus;PERV);PERV)在中国巴马小型猪封闭群中的携带情况.根据本实验室已建立的PCR、RT-PCR检测方法,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(p0l)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测;同时根据目前通用的env基因分型方法检测PERVenv-A、env-B、env-C的存在与表达情况.所有被检样品不仅存在PERV gag、pol、env特异性DNA,而且都能够转录为RNA;所有样品同时存在PERV A、B亚型的前病毒,且有70%个体还同时存在PERV-C亚型前病毒,但仅有90%样品检测到PERV-A亚型的表达,50%检测到PERV-B亚型的表达,而所有的样品均未检测到PERV-C型的表达.巴马小型猪封闭群外周血淋巴细胞基因组中存在PERV-A、B、C 3种亚型,但仅有A、B两种亚型能够表达.PERV-A、B、C 3种亚型的同时存在,预示着巴马小型猪封闭群中存在不同亚型病毒重组的可能性. 相似文献
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作者介绍了国内外猪内源性反转录病毒（PERV）研究进展,简述了中国不同品种小型猪PERV存在情况、PERV前病毒全基因克隆与序列分析、细胞水平鉴定方法、感染HEK293细胞研究平台的创建、猪A3F对PERV的抑制作用研究,以及从分子遗传学上揭示不同品系PERV特异性等创新性研究成果,分析了五指山小型猪近交系具有PERV基因拷贝少且没有PERV-C等特异性,以及展望培育中国PERV阴性猪新品系方法等研究,以期为人类异种器官移植和生物医用材料产品安全性研发,解决小型猪PERV疾病传播危险性提供科学对策和新的方向。 相似文献
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中国巴马小型猪内源性反转录病毒的检测 总被引：2，自引：0，他引：2
目的 :对我国特有巴马小型猪内源性反转录病毒 ( porcine endogenous retrovirus,PERV)的存在与 m RNA的表达情况进行检测 ,了解巴马小型猪内源性反转录病毒的携带情况。方法 :根据以往建立的 PCR、RT-PCR检测方法 ,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的 DNA和RNA样品进行 PERV核心蛋白基因 ( gag)、多聚酶基因 ( pol)及囊膜基因 ( env)的存在与表达进行检测 ;同时 ,根据目前通用的 env基因分型方法检测 PERV env-A、env-B、env-C的存在与表达。结果 :在 1 2个被检的 DNA样品中均检出了PERV特异性 DNA的存在 ;同样 ,在 1 2个被检的 RNA样品中均有 PERV特异性 RNA的表达 ,且所表达的 PERV均为 A型和 B型 ;其中有9个 DNA样品检测出 PERV-C型的存在 ,所有样品中均未检出 C型 PERV的表达。结论 :检测结果表明 1 2个被检巴马小型猪基因组中存在着内源性反转录病毒序列 ,且能以 m RNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。 相似文献
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为分析近交系连续3代次五指山小型猪内源性反转录病毒囊膜基因(PERV-env)变异特征,本研究采用PCR方法对该基因进行扩增、克隆和序列测定,将其与参考序列比对和遗传进化分析.序列分析显示:PERV-env核苷酸序列与参考序列之间的同源性为98.3 ％～99.3％,具有明显G→A突变,并且偏好发生于GA、GG.进一步分析表明,在PERV-env序列190 bp和1 875 bp位置均有G→A突变发生.PERV-env基因遗传进化树分析表明,五指山来源的PERV与国外小型猪PERV-A亲缘关系较近,但仍存在差异.本实验将有助于PERV分子特性的研究,为进一步开展异种移植中PERV的安全性评价奠定基础. 相似文献
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利用CDNA末端快速扩增技术（RACE）成功扩增了广西巴马小型猪近交系连续4代次及封闭群的猪内源性反转录病毒（PERV）3UTR,共获得8条序列（GenBank登录号分别为：GQ475493、GQ475494、GQ475495、GQ475496、GQ475497、GQ475498、GQ475499、GQ475500）,分为638、749bp 2种不同的类型,都属于PERV-A亚型。以PERV-3UTR构建遗传进化树,PERV-A,B,C分群清晰,3UTR可作为PERV亚型区分的另一基因序列。对调控元件定位分析,推测具有749bp类型3UTR的PERV病毒转录水平更高。在所获得序列的209～227bp位置,发现了＂CTTGAAACTT＂10个碱基的1.9个重复。模拟RNA二级结构,广西巴马小型猪PERV-3UTR 2种类型无论从空间构型、自由能,还是茎环数量都存在明显的不同。这些结果为全面评价广西巴马小型猪来源的PERV病原安全性提供了参考。 相似文献
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聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒 总被引：5，自引：0，他引：5
为了建立检测猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法，根据巳发表的PERV的序列，设计并合成了针对PERV核心蛋白（gag）、多聚酶（pol)、囊膜蛋白（env）基因的3对引物，预期扩增片段分别为361、150、265bp。应用PCR技术检测了PERV在4株猪源细胞中的整合情况。结果表明，在所有被检细胞的基因组中均存在有PERV的前病毒序列，应用RT-PCR检测上述4株猪源细胞中PERV特异性MRNA的表达，结果均为阳性。试验还对建立的上述2种方法的特异性进行了探讨，结果表明试验建立的PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究PERV奠定了基础，还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。 相似文献
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为构建缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5＇非编码区（5’UTR）克隆，分析5’UTR的转录调控规律，以质粒WZSP-293—5’UTR为模板，应用重组PCR方法分别扩增5’UTR与缺失引物结合区及前导序列（PBS—Leader），即51UTR（5＇长末端重复区）、U3区、R区、U3区中重复序列的51UTR等5种PCR片段，并分别将其克隆至T载体上，挑取阳性克隆，酶切鉴定插入方向，选择正确方向插入的克隆，删序并进行序列分析。结果表明，构建了系列功能区缺失的5种51UTR克隆，分别命名为UTR—PMD、LTR—PMD、UTR—U3-PMD、UTR-R—PMD、UTR—U—PMD以备后用。结论：在PERV5＇UTR的不同功能区中含有一系列可能的转录因子结合位点；中国五指山猪内源性反转录病毒（WZSP—PERV）在293细胞中传代时，不仅U3重复区数目增加，重复亚型也发生了一定的改变。 相似文献
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猪内源性反转录病毒（PERV）是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对PERV-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现PERV-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于PERV疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及PERV对人源细胞的感染机制。 相似文献
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为构建缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5′非编码区(5′UTR)克隆,分析5′UTR的转录调控规律,以质粒WZSP-293-5′UTR为模板,应用重组PCR方法分别扩增5′UTR与缺失引物结合区及前导序列(PBS-Leader),即5′UTR(5′长末端重复区)、U3区、R区、U3区中重复序列的5′UTR等5种PCR片段,并分别将其克隆至T载体上,挑取阳性克隆,酶切鉴定插入方向,选择正确方向插入的克隆,测序并进行序列分析。结果表明,构建了系列功能区缺失的5种5′UTR克隆,分别命名为UTR-PMD、LTR-PMD、UTR-U3-PMD、UTR-R-PMD、UTR-U-PMD以备后用。结论:在PERV 5′UTR的不同功能区中含有一系列可能的转录因子结合位点;中国五指山猪内源性反转录病毒(WZSP-PERV)在293细胞中传代时,不仅U3重复区数目增加,重复亚型也发生了一定的改变。 相似文献
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猪内源性反转录病毒使异种移植猪细胞、组织和器官存在风险,猪内源性反转录病毒A和猪内源性反转录病毒B都出现在猪基因组中,并能在体外感染人.猪内源性反转录病毒C只感染猪细胞,并可整合到大多数猪基因组中,但不是全部.猪内源性反转录病毒A和C的重组能感染人细胞,并大量复制.为了避免这种重组,猪内源性反转录病毒C阳性动物不能用于异种移植.为检测猪内源性反转录病毒C阳性猪,建立了多种不同的方法,如用不同引物建立的特异性PCR技术、异种高灵敏度的巢氏PCR技术和可定量前病毒拷贝数的实时定量PCR技术.实时定量PCR技术可用于区分污染和真正的前病毒分子.这些PCR方法经过优化,具有稳定的检测灵敏性.首先进行PCR1,如果检测结果为阴性,则进行PCR2或PCR5或巢氏PCR；如果检测结果是阳性,则进行实时定量PCR来排除污染.使用这些方法可评估猪内源性反转录病毒C的流行程度和识别未感染猪内源性反转录病毒C的动物.由于可能从其它动物细胞带来污染,不是使用耳活体检测,而是采用血细胞检测. 相似文献
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DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰,对生物体基因的表达有重要的调控作用。为了研究五指山猪肌肉组织基因组DNA的甲基化程度,试验利用MSAP技术,使用筛选的10对引物扩增,检测五指山猪背最长肌和半腱肌的甲基化程度。结果显示:1月龄、2月龄、4月龄五指山猪背最长肌的平均甲基化率分别是44.78%、41.58%、38.92%;1月龄、2月龄、4月龄五指山猪半腱肌的平均甲基化率分别是41.70%、39.39%、38.81%。研究结果为五指山猪生长发育规律、系统选育及矮小机制等方面的研究提供表观遗传学依据。 相似文献
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根据猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag)基因、多聚酶(pol)基因、囊膜(env)基因和β-肌动素(β-actin)基因核酸序列设计并筛选特异性引物6对,利用PCR方法对五指山小型猪PERV gag、pol和env基因存在情况进行系统检测;利用半定量RT-PCR方法对五指山小型猪PERV gag、pol和env基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉7个组织中的表达情况进行系统检测与分析.结果显示,在202个被检样品中,gag、pol基因和envB基因亚型均存在,envA基因亚型仅3个样品未发现,envC基因亚型共检出34个,检出率为16.8%.所测试的7个组织均表达gag、pol和env基因序列,但envC仅在1头个体的组织中表达.各组织gagmuRNA丰度以肾脏为最高,其次为肺、心、肝、脾,脑和肌肉组织的丰度最低.各组织pol mRNA丰度以肾脏为最高,其次为脾、肺、肝、心,肌肉和脑组织的丰度最低.各组织envA、envBmRNA丰度信号强度分布与gag、pol信号类似,亦以肾脏为最高,脑和肌肉组织的丰度最低.各组织envC mRNA的信号强度明显低于envA、envB.以上结果表明,在五指山小型猪中存在PERV,且在各组织中的表达量有差异. 相似文献
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为了了解海南地方猪TLR4基因的多态性,试验采用PCR技术对五指山猪、临高猪和屯昌猪的TLR4基因组序列进行了克隆、测序,应用DNAStar和BioEdit软件分析其序列,SMART、SOPMA、SWISS-MODEL在线软件分析TLR4蛋白的结构,并预测二级结构和三级结构。结果表明:获得的三个品种海南地方猪TLR4基因DNA序列全长均为10 435 bp,其中编码区长2 526 bp,编码841个氨基酸。三个品种猪TLR4基因序列种内比对时,五指山猪在种内有1个核苷酸位点存在多态性;屯昌猪在种内有6个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;临高猪在种内有3个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。三个品种猪TLR4基因序列种间比对时,有27个核苷酸位点存在多态性,其中2个为错义突变,导致氨基酸改变。三个品种猪的TLR4基因序列的同源性在99.8%～99.9%之间,高度保守。海南猪TLR4基因在7 209位点的G→T突变和7 781位点的G→A位点突变引起了TLR4蛋白二级结构和三级结构发生改变。说明海南地方猪TLR4基因存在多态性,并且其多态性引起的结构改变可能使TLR4基因功能发生变化。 相似文献
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为了解海南地方猪TLR2基因的多态性,本研究采用PCR法从五指山猪、临高猪和屯昌猪3种海南地方猪的血液中克隆Toll样受体2(TLR2)基因,并进行测序及序列分析。结果显示,3种海南地方猪TLR2基因的扩增长度均为2649bp,编码区长2358bp。3种猪TLR2基因序列的种内比对结果显示,五指山猪种内有7个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;屯昌猪种内有5个核苷酸位点存在多态性,均在编码区外;临高猪种内有4个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。种间比对结果显示3种猪有12个核苷酸位点存在多态性,其中3处为错义突变,导致氨基酸改变。同源性分析结果显示,3种猪的TLR2基因序列高度保守,同源性在99.6%~99.9%之间。蛋白质结构预测分析显示,海南猪TLR2基因在876、1454位点呈现的AG突变均引起了其蛋白质二级结构和三级结构的改变,提示可能存在TLR2功能的变化。本研究填补了海南地方猪TLR2基因多态性空白,为深入研究TLR2基因多态性与猪疫病易感性的关系提供基础研究资料。 相似文献
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参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。 相似文献
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旨在探究五指山猪和杜洛克猪免疫和脂质代谢相关基因的选择信号差异。本研究从海南国家级五指山猪保种场采集30头4月龄健康(10公,20母)五指山猪的耳组织进行全基因组重测序(whole genome sequencing,WGS),从NCBI数据库下载29头杜洛克猪全基因组重测序数据(SRA：PRJNA378496);通过生物信息学方法分析59个样本WGS数据的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs),进行SNPs过滤,定位SNPs在基因组的位置,分析其结构特征和基因型频率,并注释对应基因的功能;使用XP-CLR方法筛选五指山猪基因组受到强烈选择的区域,分析两个品种相关通路基因的功能差异。结果表明,五指山猪平均每个样本共筛选到36 961 902个SNPs位点,内含子区域分布最多,平均每个样本16 729 364个,约占45.26%,编码区(起始、终止密码子)平均有2 073个SNPs;五指山猪受选择的基因组区域主要集中在免疫、代谢和神经功能相关通路;免疫反应通路中,9个基因(TGFBR2、IL26、IL15、BMPR2、TNFSF15、TNFSF4、TNFSF8、ACKR4、TNFRSF11B)功能区域SNPs位点在五指山猪中只存在一种突变纯合基因型,而在杜洛克猪大部分个体中存在3种基因型(野生纯合基因型、杂合子、突变纯合基因型),其中野生纯合基因型比例最高;脂类代谢通路中,关键调节基因IRS2、PRKG1、ADCY5的基因型频率与免疫反应基因类似。在五指山猪中突变纯合基因型比例为100%,在杜洛克猪中野生纯合基因型所占比例为48%~93%(14/29-27/29)。本研究筛选出与五指山猪免疫性状相关的候选基因9个、与脂类代谢相关的候选基因3个,发现五指山猪免疫、代谢和神经功能相关基因的受选择程度强于杜洛克猪,为揭示五指山猪特色性状形成的分子机制提供参考。 相似文献