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1.
为揭示HOPX基因在鸡脂肪生长发育中的作用,研究采用Real-time RT-PCR和启动子荧光素酶报告基因技术,分析过表达HOPX基因对鸡脂肪生长发育重要基因的表达及其启动子活性的影响。结果表明,与空载体对照组(p CMV-HA vector)相比,HOPX基因能够促进A-FABP和PPARγ基因表达及其启动子活性,抑制KLF 7基因表达及其启动子活性,但对FAS基因表达及其启动子活性没有影响。研究结果显示,过表达HOPX基因可能促进鸡前脂肪细胞分化。 相似文献
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构建猪SIRT1基因全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染猪原代卵巢颗粒细胞,探讨SIRT1基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明,猪SIRT1基因的CDS区全长大小为2 229 bp,与NCBI发布的猪SIRT1基因m RNA序列(EU030283.2)一致;转染p EGFP–C1–SIRT1载体的颗粒细胞中SIRT1的m RNA表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组(P0.01);p EGFP–C1–SIRT1转染组细胞中,AMPK–α1和AMPK–α2基因的m RNA表达量显著高于空载体对照组,且细胞中AMPKαThr172位点的磷酸化水平显著升高(P0.05)。结果表明,体外培养的原代猪卵巢颗粒细胞中的SIRT1基因过表达使AMPK的表达显著增加,影响AMPK的活性,推测SIRT1可能通过AMPK在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用。 相似文献
3.
【目的】针对禽类干细胞研究中,存在转染效率与干涉效率低下的问题,通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中Piwi基因的干涉效果,探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术,分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF）与生殖脊,其中CEF作为PGCs细胞的饲养层,生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞,并通过形态学、化学方法（PAS糖原染色、AKP 活性检测）和免疫学方法（TERT抗体、SSEA-1抗体）对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的mRNA序列（NM_001098852）,利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth siRNAs,并将通用无义序列BLOCK-iTTM Alexa Fluor® Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照siRNA。同时,在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,将其插入线性化空载体 pRNA-U6.1,构建不同的shRNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的siRNA和shRNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义siRNA以及仅带有GFP荧光标记基因的shRNA载体作为阴性对照,检测siRNA和shRNA转染效率,确定最佳转染条件。其次,将试验组siRNA和shRNA在优化条件下转染PGCs细胞,分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞,提取各个时间段的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因mRNA表达水平,并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后,确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与siRNA或shRNA载体量的配比,得出siRNA转染最优条件为siRNA﹕LipofectamineTM 2000=50 pmol﹕2 μL; shRNA转染最优条件为shRNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5 μL。在以上最优转染条件下,将试验组siRNA和shRNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在siRNA干涉组中,阴性siRNA组和空白组相比,Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显著（P＞0.05）;而3个试验组siRNA与阴性对照组相比,在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显著下降（P＜0.05）,但在144 h时表达差异不显著（P＞0.05）。在shRNA干涉组中,空白组和阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显著（P＞0.05）;而3个试验组与阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上均显著下降（P＜0.05）。与siRNA干涉试验组相比,shRNA 载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】siRNA与shRNA均能较好抑制目的基因的mRNA表达,不同干涉效果表明采用shRNA 载体具有更好及更长时间的抑制作用,这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。 相似文献
4.
【目的】转座子（transposon, Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty（SB）、piggyBac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol2 3种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至pT2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至pT3-PST载体,获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、pCMV-Tol2以1﹕1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）,同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后,用荧光显微镜进行检测GFP表达率,提取细胞基因组,以Amp基因作为内参,进行实时荧光定量PCR,检测GFP插入拷贝数;根据被剪切位置上下游序列设计引物,进行实时荧光定量PCR,检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后,用浓度为500 µg·mL-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞基本全部死亡（10 d）,将细胞进行吉姆萨染液染色,统计耐药细胞数,从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%,且差异不显著（P＞0.05）。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组,但差异不显著（P＞0.05）,均显著高于对照组（P＜0.05）。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组（P＜0.05）,但SB和PB组之间差异不显著（P＞0.05）。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞,G418抗性筛选结果表明,SB组耐药细胞数显著高于PB和Tol2组（P＜0.05）,但PB和Tol2两组差异不显著（P＞0.05）,此3组均极显著高于阴性对照组（P＜0.01）。【结论】SB转座子系统在细胞水平的转座效率优于PB和Tol2,为细胞水平的转基因研究提供有效基因转移工具。 相似文献
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关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族。该家族包括MyoD1,Myf5,MyoG和Myf6,只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中;在其他的非肌细胞中, MyoD基因家族会被抑制。该家族中,MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等方面的调节,以维持个体骨骼肌的相对稳定,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素,具有尤为重要的作用,已成为研究热点。目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多,表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理;在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达情况,但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确。文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响,为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础。【方法】通过设计特异性引物克隆关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2;同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1（+）和pGL3-Basic基本骨架,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体pGL3-P1、pGL3-P2。重组质粒经酶切和测序鉴定后,利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞,30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性。最后根据荧光素酶的相对活性来分析 MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响。【结果】克隆得到的关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确,载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pGL3-P1和pGL3-P2经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;与相应剂量的对照组相比,转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD后,pGL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强,其中,在转染量为200 ng时增强作用最强,差异显著(P＜0.05);转染pcDNA3.1（+）-MyoG后,虽然对pGL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用,但差异不显著(P＞0.05);而转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG后,pGL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显 (P＞0.05)。【结论】在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P＜0.05);而外源过表达转录因子 MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性。说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。 相似文献
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前期研究发现,HOPX基因在鸡脂肪组织高表达,为了解该基因在脂肪发育过程中的作用,采用RT-PCR方法,扩增和克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并进行序列分析;采用real-time RT-PCR和半定量RT-PCR的方法,开展了HOPX基因的组织表达谱分析、HOPX基因在东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系脂肪组织发育过程中的表达差异分析以及鸡脂肪细胞分化过程中的表达分析。研究结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区为222 bp,编码73个氨基酸。HOPX基因在鸡的多种组织中表达,其中,在脂肪组织中的表达量最高;在高、低脂系肉鸡的脂肪组织生长发育过程中,HOPX基因的表达均随年龄增长而上升,且高脂系鸡HOPX基因的表达量高于低脂系;在鸡脂肪细胞分化过程中,HOPX基因的表达呈上升趋势。HOPX基因的表达分析结果提示,该基因在鸡脂肪组织生长发育过程中发挥作用。 相似文献
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【目的】构建ChREBP基因siRNA表达质粒,干扰ChREBP在原代培养猪脂肪细胞的表达,研究其在葡萄糖诱导脂肪细胞生脂中的作用。【方法】合成4对靶向ChREBP基因的siRNA寡核苷酸,分别连接于pcDNA™6.2-GW/EmGFP载体构建siRNA表达质粒,测序验证后,采用脂质体介导法转染从3日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,荧光定量RT-PCR检测ChREBP基因沉默效率;以葡萄糖浓度为0—20 mmol·L-1的培养液培养转染细胞48 h,测定生脂及生脂基因表达变化。【结果】筛选出了1个转染效果好、ChREBP基因沉默效率达85%的siRNA表达质粒,转染原代培养猪脂肪细胞后,细胞生脂水平及生脂基因ACC1和FAS mRNA表达比阴性对照表达质粒转染细胞和未转染细胞显著降低（P＜0.05）,且生脂水平不受葡萄糖水平的影响（P＞0.05）。【结论】构建的siRNA表达质粒能有效干扰猪脂肪细胞ChREBP表达,葡萄糖通过转录因子ChREBP调控猪脂肪细胞生脂及生脂基因表达。 相似文献
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《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2020,(2)
【目的】构建ggamiRNA155前体基因（preggamiRNA155）真核过表达载体,验证ggamiRNA155在MDCMSB1细胞中的表达效果,探究其对MDCCMSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增ggamiRNA155前体基因片段preggamiRNA155,并将其克隆入pMD 18T载体,构建克隆载体pMD18TpreggamiRNA155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA真核表达载体和pMD18TpreggamiRNA155,preggamiRNA155酶切回收片段与pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA的酶切回收片段进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155,对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCCMSB1细胞中,应用实时荧光定量PCR ( Realtime PCR )检测ggamiRNA155的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154 bp的鸡preggamiRNA155基因。成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155,瞬时转染MDCCMSB1细胞后ggamiRNA155表达水平显著增加,且MDCCMSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体,其可在MDCCMSB1细胞中过表达ggamiRNA155,且可促进MDCCMSB1细胞的体外增殖。 相似文献
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《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2021,(2)
【目的】构建ggamiRNA155前体基因（preggamiRNA155）真核过表达载体,验证ggamiRNA155在MDCMSB1细胞中的表达效果,探究其对MDCCMSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增ggamiRNA155前体基因片段preggamiRNA155,并将其克隆入pMD 18T载体,构建克隆载体pMD18TpreggamiRNA155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA真核表达载体和pMD18TpreggamiRNA155,preggamiRNA155酶切回收片段与pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA的酶切回收片段进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155,对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCCMSB1细胞中,应用实时荧光定量PCR ( Realtime PCR )检测ggamiRNA155的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154 bp的鸡preggamiRNA155基因。成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155,瞬时转染MDCCMSB1细胞后ggamiRNA155表达水平显著增加,且MDCCMSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体,其可在MDCCMSB1细胞中过表达ggamiRNA155,且可促进MDCCMSB1细胞的体外增殖。 相似文献
10.
【目的】明确细胞因子信号转导抑制因子1基因（SOCS1）过表达对乳腺发育关键信号通路（JAK/STAT）相关基因表达的影响,为揭示SOCS1基因调节猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用机制提供参考依据。【方法】构建SOCS1基因过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC,分别转染猪乳腺上皮细胞,然后通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测转染后JAK/STAT信号通路相关基因的表达变化。【结果】以过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC分别转染猪乳腺上皮细胞,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的SOCS1基因相对表达量极显著高于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组（P<0.01,下同）;转染48和72 h后,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组猪乳腺上皮细胞的OD值极显著低于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组,说明过表达载体pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制猪乳腺上皮细胞的增殖能力;过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的细胞凋亡率... 相似文献
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【目的】研究绵羊核因子I/B （nuclear factor I/B,NFIB）基因的组织表达规律,并克隆中国美利奴羊（新疆军垦型）NFIB基因的全长编码区（coding sequence,CDS区）序列。【方法】采用半定量RT-PCR的方法分析NFIB基因的组织表达谱和皮肤表达特性,利用RT-PCR扩增绵羊NFIB基因的全长CDS区、克隆测序,并进行序列分析。【结果】①NFIB基因在绵羊多种内脏器官和皮肤组织中都有着不同程度的表达,且在皮肤组织中表达较高;NFIB基因在超细毛品系体表不同部位皮肤组织中的表达水平不存在显著性差异（P＞0.05）;同时在6个不同品系/品种绵羊体侧部皮肤组织中的表达水平也不存在显著性差异（P＞0.05）;超细毛品系绵羊皮肤组织NFIB基因的表达水平在不同季节存在显著性差异（P＜0.05）;②绵羊NFIB基因编码区至少存在3种剪接形式,其开放阅读框（open reading frame,ORF）的长度依次为1 263、1 128 和1 038 bp,分别编码420、375和345个氨基酸。【结论】中国美利奴羊（新疆军垦型）NFIB基因在皮肤组织中的表达量较高,其在超细毛品系羊体侧部皮肤组织中的表达量具有显著的季节性差异;绵羊NFIB基因至少可以编码3种不同的蛋白剪接体（protein isoform）。 相似文献
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【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。 相似文献
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牛myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418 筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高（P＜0.01）,肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高（P＜0.01）。细胞形态观察显示成肌细胞融合为肌管。【结论】构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6能在成肌细胞中高效表达,myf6基因促进了成肌细胞向肌肉细胞分化。 相似文献
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【背景】 TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】 构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号：XM_417232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P<0.01）。流式结果显示：24 h 检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%（早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%）,转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著（P<0.05）。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%）,转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著（P<0.01）。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。 相似文献
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【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。 相似文献
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【目的】明确鸡干扰素调节因子7 （chIRF7）的分子特征及chIRF7基因在不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展IRF7基因调控鸡相关组织发育和抗病毒研究打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增chIRF7基因编码区（CDS）并构建其重组真核表达载体,通过SOPMA、SWISS-MODEL及BioEdit等在线软件预测分析chIRF7蛋白的二、三级结构及结构域保守性;以重组真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞系（DF-1）,观察融合蛋白的亚细胞定位情况及分析过表达融合蛋白对新城疫病毒（NDV）复制的影响;采用实时荧光定量PCR检测chIRF7基因在鸡胚发育第14 d（E14d）及鸡出壳第1 d（H1d）、第7 d（H7d）和第14 d（H14d）不同组织中的表达情况。【结果】将从鸡外周血淋巴细胞中扩增获得的chIRF7基因CDS序列插入真核表达载体pEGFP-C1的酶切位点即成功构建获得重组真核表达载体pEGFP-chIRF7。chIRF7蛋白二级结构由无规则卷曲（占51.12%）、α-螺旋（占26.48%）、延伸链（占16.70%）和β-转角（占5.70%）组成;鸡与其他禽类、人类和哺乳动物的IRF7氨基酸序列相似性均较低,且5个功能结构域不保守。经聚肌胞苷酸［Poly （I:C）］或NDV处理DF-1细胞后,可使融合蛋白EGFP-chIRF7由细胞质定位转变为细胞核定位;而在细胞内过表达融合蛋白EGFP-chIRF7可降低NDV的复制能力和细胞致病性。chIRF7基因在鸡不同发育阶段各组织中均有不同程度的表达,且以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和腺胃,在腿肌中的相对表达量较低;从E14d发育到H14d,chIRF7基因在肺脏中的表达呈先下降后趋于稳定的变化趋势,在肝脏、腺胃、心脏和腿肌中呈先下降后上升再下降的变化趋势,在脑组织中呈先稳定再下降的变化趋势,在胸肌和眼球中的表达则趋于稳定。【结论】 IRF7在不同物种中的相似性较低且结构域不保守,经外界刺激诱导表达的chIRF7会发生细胞核移位而具有抗病毒感染效果。IRF7基因在鸡不同发育阶段的肺脏、肝脏和腺胃中高表达,说明对这3个组织的发育可能具有调控作用。 相似文献
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【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。 相似文献
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【目的】研究雄性奶山羊Prm1基因的表达规律并克隆该基因,为奶山羊精子发生过程的研究提供分子基础。【方法】利用PCR技术从关中奶山羊睾丸组织中扩增出Prm1基因的全CDS序列,对其进行同源性比较和进化比较。同时用PCR、western blotting及免疫组化技术检测Prm1在不同年龄雄性关中奶山羊睾丸中的表达。将克隆出的奶山羊Prm1基因与pIRES-GFP载体连接构建重组真核表达载体,转染GC1细胞和人的脐带基质细胞检测Prm1基因的超表达情况。【结果】Prm1基因在成年奶山羊睾丸组织中的表达量很高,且只定位于精子头部,在其它时期的睾丸组织中基本不表达。同时扩增得到了关中奶山羊Prm1 基因CDS序列,与其它物种比对,发现其与许多物种具有较高的同源性,与牛的同源性高达97.4%,最后在GC1细胞和人的脐带基质细胞中进行了超表达。【结论】得到了关中奶山羊Prm1基因的表达规律及完整的CDS序列。 相似文献