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【目的】研究肌肉因子IL-15（interleukin 15）对猪骨骼肌成肌细胞增殖与凋亡的影响,为进一步研究IL-15在动物肌肉品质调控和骨骼肌疾病治疗提供依据。【方法】构建IL-15过表达慢病毒载体GV-492-IL-15,体外无菌分离培养猪骨骼肌卫星细胞,诱导分化,并通过免疫荧光染色进行成肌细胞验证。将成肌细胞转染IL-15过表达重组慢病毒载体,试验分别设置空白对照组（Control）、转染阴性对照病毒组（IL-15-）和转染GV-492-IL-15（IL-15+）慢病毒试验组（n=3）。培养72 h后,收集细胞和培养上清液。分别采用实时定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot技术分析目的基因和蛋白的表达情况,采用ELISA试剂盒分析培养液中IL-15含量,采用CCK-8试剂盒分析成肌细胞活力,采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,采用Western Blot技术检测与细胞凋亡密切相关的caspase-3蛋白表达水平的变化。【结果】（1）经鉴定后的质粒转染293T细胞,细胞内可观察到明显的绿色荧光,经Western Blot检测,可以观察到20 kD附近处有特征条带;（2）分离培养的猪骨骼肌卫星细胞呈梭形或纺锤形,诱导后可分化为呈管状的成肌细胞。将分化后的成肌细胞,进行α-SMA单克隆抗体免疫荧光染色,视野中90%的细胞呈阳性反应,胞浆染成红色,表明细胞为骨骼肌成肌细胞。（3）转染GV-492-IL-15慢病毒后,与对照细胞组相比,成肌细胞内IL-15 mRNA和蛋白相对表达量均极显著升高（P<0.001）,但培养液中IL-15蛋白水平变化不大（P>0.05）。CCK-8结果显示,过表达IL-15可增强细胞的增殖能力（P<0.05）。与对照组相比,转染GV-492-IL-15慢病毒的细胞早期凋亡率差异不显著（P>0.05）,但细胞晚期凋亡率显著下降（P<0.05）。与对照组相比,转染慢病毒组细胞中caspase-3蛋白有下降的趋势,但差异不显著（P>0.05）。此外,转染IL-15过表达慢病毒可使G1期细胞比例显著下降,S期和G2/M期细胞比例显著升高（P<0.05）。【结论】在正常生理条件下,IL-15是定位在细胞内并发挥作用的,IL-15过表达对猪骨骼肌成肌细胞早期凋亡没有显著影响,但可以抑制其晚期凋亡,并促进细胞增殖。这一研究将为IL-15正向调控猪骨骼肌肌肉品质和治疗相关肌肉疾病提供技术和理论依据。 相似文献
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【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。 相似文献
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【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。 相似文献
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【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明：在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid）预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA, CDK1, CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）和促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组（P<0.01）;双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高（P<0.01）,结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性（P<0.01）;同时,qPCR及Western Blot表明：过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达（P<0.01）。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力（P<0.01）,通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组（P<0.01）,促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后, G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组（56.81%,P<0.01）,减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,降低了促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】 miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。 相似文献
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【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus,DTMUV) E蛋白全长及其结构域I、II和III (DI、DII和DIII)对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)的细胞周期与凋亡的影响。【方法】本研究设计、合成DTMUV E蛋白全长及其DI、DII和DIII真核表达质粒,并转染至DEF,用流式细胞仪检测不同蛋白引起的DEF细胞凋亡和细胞周期的变化。【结果】细胞凋亡结果显示：质粒转染细胞24 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是16.4%、15.1%、14.0%和17.2%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是23.4%、18.5%、26.7%和29.4%。细胞周期检测结果显示：E蛋白全长及DI、DII、DIII的质粒转染细胞24、36 h后,DNA合成期(S期)细胞比例都明显高于pEGFP-N1空载体转染组。质粒转染24 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为5.43%、22.58%、12.75%和12.80%;质粒转染细胞36 h后,... 相似文献
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【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）,分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS（coding sequence）区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体（RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C）,转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达变化。【结果】鸭RIG-I基因CDS区全长2 802 bp,共编码933个氨基酸;不同结构域缺失突变体的真核表载体转染DF1细胞后,重组蛋白均在DF1细胞中表达;RT-qPCR结果显示,N端能显著激活RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达上调。【结论】 duRIG-I及不同区段均能在DF1细胞中表达,其中N端在调节RLR抗病毒信号通路下游基因的表达过程中发挥了重要作用。 相似文献
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《福建农业学报》2021,(1)
【目的】对bPAG16基因进行优化和合成,构建proEM-bPAG16重组表达载体,将重组质粒转染至HEK293细胞中,获得bPAG16重组蛋白,为家畜早期妊娠诊断技术的研发提供技术支撑。【方法】通过生物学技术对bPAG16基因密码子进行优化和人工合成,经T4 DNA连接酶将bPAG16基因插入到proEM载体中,构建重组载体proEM-bPAG16,将其转染至HEK293细胞中进行瞬时表达,重组蛋白经Ni-IDA亲和柱纯化后,采用SDSPAGE、Western Blot检测其表达效果。【结果】优化后的bPAG16基因密码子适用指数(CAI)由原来的0.77提高到0.96,GC含量由48%提高到58%。重组载体proEM-bPAG16双酶切后分别获得1 179 bp和4 369 bp的2条片段,与预期值一致;重组质粒测序结果显示,其核苷酸序列与优化后基因完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,获得重组蛋白bPAG16(rbPAG16)相对分子质量约48 kDa,经Ni-IDA亲和层析纯化后,其纯度达到90%以上。【结论】通过密码子优化策略及重组蛋白技术高效表达了rbPAG16,为奶牛早孕快速检测技术的研发奠定了基础。 相似文献
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【目的】研究miR-29a-3p下调表达对小鼠巨噬细胞凋亡及相关基因表达的影响,为探讨结核病发病机制、研发新的诊断与治疗方法提供依据。【方法】将重组抑制载体p EZX-AM02-miR-29a-3p转染RAW264.7细胞,24、36和48 h荧光显微镜观察转染效率,Real time-PCR法检测miR-29a-3p及凋亡相关基因caspase3、caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax的表达水平,流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡率。【结果】重组抑制载体转染后,细胞内miR-29a-3p表达水平明显下降;而caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax等基因的表达出现不同程度的上调;流式细胞术分析发现随着转染时间延长,细胞凋亡率增加,且36 h凋亡率最高。【结论】p EZX-AM02-miR-29a-3p重组载体可抑制小鼠巨噬细胞中miR-29a-3p的表达,通过靶向上调caspase7、caspase8、Bcl-2和Mcl-1等基因的表达促进巨噬细胞的凋亡。 相似文献
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【目的】为了探明猪圆环病毒3型的致病机制。【方法】用PCR技术扩增PCV3的ORF1-ORF7基因片段并克隆到pEGFP-C1载体,构建7个真核表达质粒后分别转染PK-15细胞,在转染后不同时间观察细胞中荧光表达情况,并检测Caspase-3活性变化。【结果】7个真核表达质粒转染PK-15细胞后均可观察到荧光,表明PCV3的ORF1-ORF7基因均可在PK-15细胞中获得表达,但在表达丰度方面存在差异。与单独的PK-15细胞和pEGFP-C1载体转染的PK-15细胞相比,7个真核表达质粒转染PK-15细胞后都未出现Caspase-3活性的显著(P0.05)变化,表明均未引起PK-15细胞发生凋亡。【结论】PCV3的ORF1-ORF7基因均无诱导PK-15细胞发生凋亡的作用。 相似文献
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【目的】探索MAR调控序列对外源人抑癌基因p53在转基因鸡体内整合稳定性的影响,为转基因禽类输卵管生物反应器的建立奠定基础。【方法】利用脂质体包埋法,将pEGFP-N1-p53/MAR重组真核表达载体转染人肝癌细胞(Hep3B),荧光显微镜和透射电镜检测转染含人野生型p53基因的Hep3B细胞形态及超微观结构的变化情况;显微注射法将脂质体介导的重组载体注入鸡X期胚盘的明区和暗区,制备G0代转基因鸡。以EGFP为报告基因,人工授精法制备G1代转基因鸡,对G0代和G1代鸡体外源基因p53进行PCR检测,并对G1代转基因鸡进行小动物活体成像检测。【结果】转染含人p53基因重组载体的Hep3B细胞明显皱缩变圆;微观结构层面,粗面内质网不明显,线粒体肿胀,细胞核中异染色质边集明显,并出现凋亡小体。G0代转基因鸡暗区组孵化率(45%)显著高于明区组孵化率(0)(P0.05),但均显著低于对照组孵化率(82.5%)(P0.05);获得4只基因组中含有外源p53基因的G0代转基因鸡,外源基因转染率为22.2%(4/18);获得2只G1代转基因鸡,转基因世代遗传率为3.08%(2/65)。【结论】重组真核表达载体pEGFP-N1-p53/MAR可以促进人肝癌细胞Hep3B的凋亡;脂质体介导的含MAR序列调控元件的pEGFP-N1-p53/MAR质粒,可以提高p53在转基因鸡基因组中的整合稳定性,并可遗传给后代。 相似文献
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【目的】研究粒细胞集落刺激因子（granule cell stimulating factor,GCSF）在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响,为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据。【方法】将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×105个细胞/mL的羊成纤维细胞中,培养48 h后,利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平。通过GCSF依赖型细胞系NFS-60,利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性。通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化,并SDS-PAGE检测。加入纯化的30 ng·mL-1 GCSF蛋白后在24和48 h时,通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态,利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化。【结果】羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h,检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高。在羊成纤维细胞中,转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的（50 615.92±4 738.83）倍（P<0.01）;羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后,试验组和阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高（P<0.01）,试验组中的NFS-60的荧光强度与阳性对照组相比均差异不显著（P>0.05）,结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性。用HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,纯化得到羊GCSF蛋白。在羊成纤维细胞中添加30 ng·mL-1的羊GCSF后,体外培养24和48 h,GCSF试验组与培养基稀释液对照组相比,细胞活力变化差异不显著,而细胞周期的分布出现显著改变。24 h时,与对照组相比试验组的G1期细胞比例由(55.29±1.68)%增加到(69.37±0.24)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(15.99±0.38)%变为(15.39±0.60)%,差异不显著（P>0.05）;G2/M期细胞显著增多（P<0.05）,比例由(22.88±1.00)%增大到(26.76±0.82)%。表明在羊成纤维细胞中加入羊GCSF的24 h后,处于分裂状态和间期的细胞显著增多。48 h时,与对照组相比试验组G1期细胞比例由(65.96±0.37)%减少为(45.69±0.26)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(13.45±1.33)%增加为(37.87±2.43)%,差异极显著（P<0.01）;G2/M期细胞比例由(16.42±1.29)%变为(21.80±1.86)%,差异不显著（P>0.05）。表明加入GCSF的羊成纤维细胞在48 h时,处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多。试验组凋亡率和对照组相比,培养24 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(7.51±0.38)%和(9.16±0.46)%。48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是(5.73±0.29)%和(5.39±0.27)%。72 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(8.88±0.45)%和(5.41±0.27)%,24 h和72 h凋亡率差异极显著（P<0.01）,48 h检测时凋亡率差异不显著（P>0.05）,表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。【结论】羊成纤维细胞中可以瞬时过量表达羊GCSF,并具有生物学活性。GCSF不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控其周期,影响细胞凋亡。该结果为今后通过羊成纤维细胞介导GCSF培育具有高免疫力、高抗病性的羊进行分子遗传育种奠定了基础。 相似文献
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【目的】为了探索秦川牛（Bos taurus）SMAD1基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为BMP信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。【方法】根据Genbank牛SMAD1（NM_001077107.2）已知序列设计并合成靶向沉默SMAD1基因的干扰序列siSMAD1和阴性对照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞cDNA为模板,利用PCR技术克隆获得SMAD1基因CDS序列,构建腺病毒过表达穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到HEK 293细胞中,通过Cre-loxp重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为AD-bSMAD1,重组质粒pDC316-EGFP标记为AD-NC,用做对照组病毒,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列siSMAD1和过表达腺病毒AD-bSMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量PCR检测SMAD1基因和成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的mRNA水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。【结果】成功获得了1条能有效沉默SMAD1基因siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1基因分别下调了75.4%（诱导1d,P<0.01）、66.7%（诱导3d,P<0.01）、60.0%（诱导6d,P<0.01）、54.7%（诱导9d,P<0.01）。此外,还成功构建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10 10pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-bSMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-bSMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞0、1、3、6、9d后,与对照组相比,SMAD1基因的表达水平分别上调了2.10倍（诱导1d）、3.19倍（诱导3d）、105.3倍（诱导3d）,P<0.01）和144倍（诱导9d,P<0.01）;结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的表达。 【结论】获得了能有效沉默秦川牛原代成肌细胞SMAD1表达的特异性的干扰序列siSMAD1,以及可成功实现过表达SMAD1基因的腺病毒介导的体外表达载体,可正向调控成肌细胞的分化和肌管形成过程。 相似文献
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禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA（short interference RNA,siRNA）的禽U6启动子。【方法】以鸡基因组为模板进行PCR扩增,将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析,并将其插入报告基因载体pEGFP-N1中,获得siRNA表达载体pGFP-U6,将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA（short hairpin RNA）插入其中,获得pGFP-U6-shRNA;以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照,分别转染COS-1和DF-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆的U6启动子位于鸡28号染色体,与发表的鸡U6-3启动子同源性为97.2%,含多个Oct-1序列,不含CACCC框、SPH和PSE等聚合酶Ⅲ启动子序列,TA框不典型;在pGFP-U6-shRNA转染的哺乳动物源COS-1细胞培养中,GFP阳性细胞数和荧光总量均有所下降,但不如pGFP-H1-shRNA转染细胞显著;在pGFP-U6-shRNA转染的禽源DF-1细胞培养中,不仅GFP阳性细胞数和荧光总量显著下降,而且基因沉默效果显著优于pGFP-H1-shRNA转染细胞。【结论】成功克隆的禽U6启动子不仅能有效转录siRNA,而且转录活性具有相对的细胞种属特异性。 相似文献
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【目的】 研究外源性γ-氨基丁酸（GABA）抵抗仔猪氧化应激的作用效果,及海马神经元GABA受体调节凋亡信号通路在其中可能的介导作用,为GABA作为动物应激调节剂的应用提供科学依据。【方法】 基于成功构建的仔猪活体和大鼠海马神经元氧化应激模型,考察外源性GABA对仔猪血清及海马组织中氧化/抗氧化相关指标、仔猪日增重、脑海马GABA受体以及大鼠海马神经元中GABA受体及凋亡信号通路相关基因表达水平的影响。【结果】 低、中、高浓度的GABA灌喂组（LD+OS; MD+OS;HD+OS）仔猪血清的MDA含量均极显著低于氧化应激（OS）组(P<0.01),而GSH水平均极显著高于OS组(P<0.01),同时HD+OS 组仔猪血清T-AOC水平极显著高于OS组和对照组(P<0.01);且高浓度(100 mg·kg-1 BW)GABA降低仔猪血清MDA含量和增加GSH水平的幅度均高于低浓度(20 mg·kg-1 BW)和中浓度(60 mg·kg-1 BW)GABA。因此,后续研究仅考察100 mg·kg-1 BW GABA的作用效果及其抗氧化应激的机制。OS组仔猪0-7、8-14和0-28日龄的日增重极显著低于对照组(P<0.01),而HD+OS组0-7、8-14和0-28日龄仔猪的日增重极显著高于OS组(P<0.01);OS组仔猪15-28日龄的日增重显著低于对照组(P<0.05),HD+OS组15-28日龄的日增重极显著高于OS组(P<0.01)。以上结果表明,100 mg·kg-1 BW GABA的灌喂极显著地增加了仔猪的日增重。对照组、OS组和HD+OS组在前、中、后期的腹泻率均无显著差异(P>0.05)。氧化应激组海马组织的MDA含量极显著高于对照组和HD+OS组 (P<0.01),而T-AOC和GSH的水平均极显著低于另外两组(P<0.01),表明GABA能提高仔猪海马组织抗氧化能力。HD+OS组的海马组织GABAA和GABAB受体水平均极显著高于对照组和氧化应激组(P<0.01),表明GABA提高了海马组织GABAA和GABAB的水平。氧化应激组脑海马Bcl-2蛋白水平显著低于对照组(P<0.05),Bax和Caspase-3蛋白水平极显著高于对照组(P<0.01)。HD+OS组的Bcl-2蛋白水平极显著高于氧化应激组（P<0.01）,Bax蛋白水平极显著低于氧化应激组（P<0.01）,Caspase-3蛋白水平显著低于氧化应激组（P<0.05）。与此一致的是,氧化应激组、GABA+OS+Picrotoxin组和GABA+OS+CGP54626组大鼠海马神经元的Bax和Caspase-3蛋白水平均显著高于对照组和GABA+OS组（P<0.05）,表明GABA缓解了氧化应激状态下海马神经元的损伤,而GABA受体抑制剂的添加阻挡了GABA的抗应激损伤作用。【结论】 GABA降低了仔猪海马的氧化应激水平,而GABA抗应激的作用机制可能与其降低凋亡蛋白基因的表达相关,而GABAA和GABAB受体介导了该过程。 相似文献
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【目的】通过研究牛KLF3基因对牛脂肪分化和脂肪酸代谢关键基因表达量的作用,进而探讨KLF3 基因对脂质沉积的影响。【方法】合成干扰siRNA,筛选得到KLF3基因干扰效率最高SiRNA,分离培养秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪细胞生长至70%-90%汇合度时转染筛选得到的KLF3基因SiRNA和阴性对照SiRNA（NC）,并进行诱导分化培养至第0天和第4 天时,利用荧光定量PCR方法研究分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins α, C/EBPα）,脂肪酸代谢关键基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase α, ACCα）和脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）基因在牛脂肪细胞分化不同时期干扰KLF3基因处理组和对照组之间表达量的变化,同时在干扰KLF3基因处理并进行诱导脂肪细胞分化的第 4天采用油红O染色法观察干扰KLF3基因处理组和对照组之间脂滴差异及采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定甘油三酯含量进一步确定KLF3基因对牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢的作用。【结果】KLF3-Si2 具有最高的干扰效率达到73%。转染KLF3-Si2后PPARγ的表达量在牛脂肪细胞诱导分化的第0天 和第4 天与对照组相比分别下调了58% 和37%,达到了差异极显著（P<0.01）,C/EBPα 的表达量也分别下调了64% 和41%,达到了差异极显著（P<0.01）。脂质代谢的关键基因FABP4的表达量与对照组相比在牛脂肪细胞诱导分化的第0天和第4 天分别下调了89% 和60%,而ACCα的表达量干扰KLF3处理组与对照组相比在脂肪细胞诱导分化第0天和第4天分别下调了50% 和37%, 而FAS的表达量则分别下调了73% 和19%,都分别达到了差异极显著（P<0.01）。在牛脂肪细胞诱导分化第4天油红O染色和甘油三酯含量测定也发现干扰KLF3基因处理组与对照组相比脂滴减少,甘油三酯含量显著下降（P<0.05）。【结论】干扰牛KLF3基因可以抑制牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢关键基因表达量下调,进而影响脂肪的沉积。 相似文献
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【目的】奶牛乳腺炎一直是奶牛养殖业和奶制品行业最大的挑战之一,制约着奶业的健康发展。有效进行奶牛乳腺炎的防治,可以为奶牛的健康、生产优质乳制品提供良好保障。探究茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎作用效果,探索茶树油替代抗生素治疗奶牛乳腺炎的可行性,为茶树油治疗奶牛乳腺炎提供参考。【方法】在牛乳腺上皮细胞的培养中分别添加50、100、200、500、1 000μg·mL-1的LPS进行相关指标的检测。通过CCK-8法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡、实时荧光定量检测细胞因子表达量以及ELISA检测相关蛋白的表达量等方法检测乳腺上皮细胞的相关指标。研究构建了LPS诱导的奶牛乳腺炎模型。在200μg·mL-1 LPS诱导12h的奶牛乳腺炎细胞模型中分别添加0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%的茶树油进行相关指标的检测。【结果】CCK-8法检测细胞增殖活性,结果显示100μg·mL-1的LPS攻毒情况下,细胞已开始出现不同程度的活性下降情况。进一步使用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示在诱导12h的情况下,100μg·mL-1的LPS并未出现大量的细胞凋亡,而200μg·mL-1的LPS诱导情况下约有46%左右的细胞出现了早期凋亡和晚期凋亡。以上结果表明：试验中,200μg·mL-1 LPS诱导12h为构建奶牛乳腺炎模型的最佳条件。添加茶树油浓度为0.0004%、0.0006%、0.0008%时细胞的凋亡比例会有所下降,其中添加茶树油浓度为0.0006%的这一组保护效果最为明显,其活细胞比例71.95％,早期凋亡细胞比例22.15％,晚期凋亡细胞比例5.11％,与未添加茶树油的乳腺炎模型组活细胞相比提高了约22%。之后对有保护效果的3组进行qPCR检测细胞因子与凋亡因子表达量,结果显示随着加入茶树油的浓度上升,TNF-α表达量下调的较多,IL-6的表达量下调的较少（P<0．01）,STAT1的表达量在加入0.0004%浓度茶树油时有轻微的上调,在0.0006%和0.0008%浓度时表达量略微下调,其中添加0.0006%浓度茶树油表达量最低（P<0.05）。进一步使用ELISA法检测炎症蛋白和凋亡蛋白表达量,结果显示3组浓度的茶树油添加组均极显著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量,其中,0.0006%浓度茶树油组较其余浓度组的炎症反应蛋白的表达量最低,约为空白对照组的50%（P<0.05）,而这3组的凋亡反应相关蛋白表达量则几乎持平,约为空白对照组的55%（P<0.05）。【结论】茶树油对于奶牛乳腺炎有一定的拮抗作用,可以降低细胞凋亡比例,提高正常细胞的存活比例,并下调炎症因子与凋亡因子以及相应蛋白的表达量。 相似文献
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【目的】构建ChREBP基因siRNA表达质粒,干扰ChREBP在原代培养猪脂肪细胞的表达,研究其在葡萄糖诱导脂肪细胞生脂中的作用。【方法】合成4对靶向ChREBP基因的siRNA寡核苷酸,分别连接于pcDNA™6.2-GW/EmGFP载体构建siRNA表达质粒,测序验证后,采用脂质体介导法转染从3日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,荧光定量RT-PCR检测ChREBP基因沉默效率;以葡萄糖浓度为0—20 mmol·L-1的培养液培养转染细胞48 h,测定生脂及生脂基因表达变化。【结果】筛选出了1个转染效果好、ChREBP基因沉默效率达85%的siRNA表达质粒,转染原代培养猪脂肪细胞后,细胞生脂水平及生脂基因ACC1和FAS mRNA表达比阴性对照表达质粒转染细胞和未转染细胞显著降低（P＜0.05）,且生脂水平不受葡萄糖水平的影响（P＞0.05）。【结论】构建的siRNA表达质粒能有效干扰猪脂肪细胞ChREBP表达,葡萄糖通过转录因子ChREBP调控猪脂肪细胞生脂及生脂基因表达。 相似文献