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1.
《江苏农业科学》2016,(6)
H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是危害我国养禽业的主要病毒之一,造成了严重的经济损失。根据H9亚型AIV的HA基因设计了1对引物,建立了H9亚型禽流感病毒的RT-PCR鉴定方法。H9亚型AIV的HA基因预期扩增的目的片断长度为425 bp。对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10~(4.25)EID_(50)/100μL。建立的RT-PCR检测方法对H9、H3、H4、H5亚型AIV及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等进行检测,结果仅有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带,其他均未出现目的条带,与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的RT-PCR和病毒分离2种方法同时对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测,结果 2种检测方法的符合率达100%。说明该鉴定方法特异性强,敏感性较高。 相似文献
2.
【目的】建立H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交鉴别诊断方法。【方法】在H5和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内,选择设计2对引物,RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pGEM-T-H5与pGEM-T-H9。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针与生物素标记引物。将探针通过紫外交联方法固定在带正电荷的尼龙膜上,用生物素标记引物扩增特异性片段,扩增产物经热变性后与探针进行杂交,杂交后显色,出现明显蓝紫色斑点的判定为阳性,无斑点判定为阴性。【结果】利用建立的反向斑点杂交方法检测,H5、H9亚型禽流感病毒的血凝效价分别可达到2-9.6和2-11.9,杂交特异性好,且2亚型间无交叉反应。【结论】建立了H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,可以实现H5与H9亚型禽流感病毒的鉴别诊断。 相似文献
3.
H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）,并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru2+,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4-33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×104EID50,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒（H1、H3、H4、H5和H6亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV和IBDV）反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。 相似文献
4.
为建立鸭H9N2亚型禽流感病毒的监测及临床诊断方法,根据鸭源H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的基因序列设计1对特异性PCR引物,并以鸭源H9N2亚型禽流感病毒基因组为模板,建立鸭源H9N2亚型禽流感病毒的特异性RT-PCR检测方法,并用该方法对江苏省多地采集的疑似病料进行检测,扩增产物经测序鉴定后判断建立的方法对临床样品的检出率。结果显示,该方法可以特异性扩增鸭源H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因保守区的837 bp的序列,与对照的病毒无交叉反应,敏感性较好,最低可检测1fg基因组,临床样品的检测率为100%,表明本试验建立的鸭源H9N2亚型禽流感病毒RT-PCR特异性强、敏感性高,可用于临床快速诊断鸭源H9N2亚型禽流感病毒感染。 相似文献
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6.
《江西农业学报》2022,(4)
根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×104拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。 相似文献
7.
利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对H5、H7和H9哑型AIV cDNA的最低检出量分别为10 Pg、1 ng和10 Pg. 相似文献
8.
为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因、N9亚型流感病毒的NA基因和所有亚型流感病毒M基因的保守序列,分别设计了3对特异性引物,优化反应条件,并通过特异性试验、敏感性试验,建立了H7N9亚型流感病毒三重PCR检测方法。利用该法对H7N9亚型流感病毒进行扩增,可得到3条特异性条带(HA基因304bp,NA基因160bp,M基因458bp),其他亚型流感病毒只出现1条特异性条带,大小为458bp,对其他病原体的检测均无扩增条带。敏感性试验结果表明,该法最低能检测到0.6pgH7N9亚型流感病毒。用该法对470个样品进行检测,未发现H7N9亚型流感病毒。该法具有快速、敏感和特异等优点,可为临床检测和疾控防控提供技术支持。 相似文献
9.
《安徽农业科学》2020,(5):96-99
[目的]建立可同时鉴别检测H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的二重RT-PCR检测方法。[方法]根据GenBank中H9和H10亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物之间的浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。[结果]特异性试验结果表明,该方法可以特异性扩增出H9和H10亚型AIV对应大小的目的条带,而对其余亚型禽流感病毒及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。同时,该检测方法对H9和H10亚型AIV的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。临床样品的检测结果表明其与病毒分离结果相一致(100%)。[结论]该研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可在一管内同时鉴别检测H9与H10两种亚型AIV,为H9与H10亚型AIV的监测提供了技术支撑。 相似文献
10.
禽流感病毒H5和H9亚型RT-PCR检测方法的建立 总被引：7，自引：2，他引：5
根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件,该方法敏感性可达10^-3,特异性好,与NFV、IBV与H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30％,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。 相似文献
11.
【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。 相似文献
12.
【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10~(-4),最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL~(-1),根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到10~(8.5)TCID50,每0.1 mL病毒含量达到10~(8.5)EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10~(-2),最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL~(-1)。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。 相似文献
13.
【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后,能够稳定的在豚鼠间传播,可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN,应用小鼠动物模型,研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力,以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点,探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010（H9N2）在小鼠的肺脏进行传代,将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠,传播九代后,用MDCK细胞扩繁病毒,得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序,推断各基因编码的氨基酸,与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对,得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点;解剖小鼠,获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠,滴定各组织中的病毒滴度,检测病毒的组织噬性;乙醚麻醉小鼠后,每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠,检测小鼠的幸存率和发病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后进行病理切片和免疫组化,比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,其MLD50为103.5EID50,106EID50、105EID50、104EID50攻毒剂量的小鼠幸存率是0,而原毒JN对小鼠不致死,JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为106-103EID50的小鼠,体重明显减少,临床症状也很明显,攻毒后3-8 d,小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状,而原毒JN在106EID50时,小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同,都是只能特异性结合SAa-2,6Gal受体,具有人样流感病毒的受体结合特性;JN病毒仅能在小鼠肺部检测到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不仅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑部都能检测到。【结论】 JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T这两个点突变,就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。 相似文献
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【目的】探讨H9N2亚型流感病毒在野鸟中的存在与传播,为广西流感疫情动态监测和防控及人流感预防监测提供重要依据。【方法】采集广西野鸟肺脏组织,将病料接种于9~11日龄SPF鸡胚尿囊腔进行分离培养,血清学试验鉴定HA和NA亚型,并克隆扩增其HA和NA基因。【结果】该分离株能被H9亚型阳性血清抑制,神经氨酸酶抑制（NI）试验结果将其鉴定为N2亚型,判断该病毒属于H9N2亚型流感病毒,命名为A/wild bird/Guangxi/H2/07,对HA和NA基因进行序列分析,发现与流感病毒H9亚型和N2亚型同源性最高,分别达到82.4%~99.0%和83.1%~99.9%。【结论】H9N2亚型流感病毒已在广西野鸟中存在,该结论为广西流感疫情动态监测和防控提供了重要依据。 相似文献
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【目的】通过分析1998—2021年间我国人感染H9N2亚型禽流感病例的发病时间、所在省份、年龄和性别等信息,明确H9N2亚型禽流感病毒的流行病学特征;通过分析人源H9N2亚型禽流感病毒的基因特征,阐明人源H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化规律;为H9N2亚型禽流感病毒跨种间传播的预警和防控提供数据支撑。【方法】基于流感基因数据库、病例报道和文献资料,获得1998—2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒的病例信息和毒株序列数据。从时间、空间、性别和年龄的分布对感染病例进行分析,明确人源H9N2亚型禽流感病毒感染的流行病学特征。通过DNASTAR中的MegAlign软件对人源H9N2病毒的各基因片段的核苷酸序列进行同源性分析,利用MEGA7.0软件构建系统进化树和分析病毒蛋白关键位点,揭示遗传演化趋势和病毒蛋白关键氨基酸位点的变异情况。通过GISAID网站下载2019—2021年间我国H9N2亚型禽流感病毒的核苷酸序列,利用mafft比对后在MEGA7.0中查看人源与禽源H9N2病毒关键氨基酸位点的突变差异,揭示当前人源和禽源H9N2病毒可能引起的风险。【结果】1998—2021年我国... 相似文献
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不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制（HI）和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变（S→N）,导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点（S145）为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。 相似文献
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【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein/MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50 min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIV RT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。 相似文献
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【目的】为确定中国华东地区家禽中禽低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza, LPAI)的流行和分布状况。【方法】 2002年7月至2009年9月在江苏省扬州市活禽市场 (live poultry markets, LPMs)采集来自不同省份的家禽泄殖腔拭子11 645个,用鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒,进行了长达8年的LPAI的病毒学监测。【结果】禽流感阳性样品1 158个,总分离率9.94%。所分离到的亚型及各亚型分离率从高到低依次为H3、H6、H11、H1、H4、H9、H10、H8。【结论】禽流感的分布季节性非常明显,以冬、春为高,各亚型又有其不同分布特点。到目前为止,已经从家鸭中分离到8种HA亚型,依次为H1、H3、H4、H6、H8、H9、H10、H11;7种NA亚型,包括N1、N2、N3、N4、N5、N6、N8,两者之间有17种组合,与野鸭的带毒情况十分相似。家鸭还很容易发生混合感染,2007年以来以H6亚型为主,H3、H11、H4、H9等很多亚型都可与其混合感染,这为禽流感病毒(avian influenza viruses, AIVs)基因重组产生新的亚型及毒力的变异提供了很好的载体。 相似文献
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A型流感病毒中国分离株PB1-F2基因进化分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】明确国内鸡源H9N2禽流感病毒（AIV）的PB1-F2基因分子进化特征,并进一步全面了解国内A型流感病毒（IAV）流行株的PB1-F2的流行情况。【方法】对分离自北方发病鸡群中的14株H9N2亚型 AIV进行了PB1-F2基因的克隆和序列测定,并从GenBank数据库下载了禽源、猪源和人源H5N1和H9N2亚型AIV、人源和猪源H1N1和H3N2 IAV的PB1基因共计337个,系统的对国内不同宿主来源的IAV 的PB1-F2基因进行了分子进化分析。【结果】上述IAV的PB1-F2基因形成了6个不同的进化分支。推导的PB1-F2蛋白表现出长度的多态性,因IAV的HA类型和宿主来源的不同,其表达功能性PB1-F2蛋白的比率也存在差异。【结论】本研究明确了国内IAV 的PB1-F2基因的系统进化特征,为该基因功能的研究提供了分子流行病学资料。 相似文献