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【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。 相似文献
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枣树ZjAPX基因的原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了解枣树抗氧化系统中抗坏血酸过氧化物酶基因的作用和功能,将从枣树结果枝cDNA文库中筛选获得的ZjAPX cDNA序列,连接到原核表达载体pGEX-4T-2,导入E.coli体内进行了表达产物鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明,1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h表达了蛋白产物;IPTG的浓度和诱导时间优化表明,1.2 mmol/LIPTG诱导5 h时,蛋白的表达量最大。研究为枣抗坏血酸过氧化物酶基因生物学功能的深入研究奠定了基础。 相似文献
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基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白. 相似文献
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为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。 相似文献
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果蝇抗菌肽基因（Andropin）的原核表达与活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆果蝇抗菌肽Andropin基因,以期利用原核表达系统生产高活性抗菌肽。【方法】首先化学合成了目的基因的2个片段和1对引物,然后利用重叠区互补PCR法得到抗菌肽Andropin的全基因序列。构建了融合表达载体pET32a-Anp,并转入感受态细胞OrigammiB进行原核融合表达。重组菌株诱导表达后,用His-Tag Purification kit亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的蛋白用肠激酶切割并进行活性分析。【结果】在诱导温度37℃、1mmol/LIPTG诱导培养4h的条件下,可获得高效表达的融合蛋白;融合蛋白的表达量占总蛋白的30%,分子质量约为28ku,可溶性达70%以上;抗菌活性试验表明,表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。【结论】重组工程菌表达得到Andropin的融合抗菌肽,且其具有抗菌生物学活性。 相似文献
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利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg2+结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。 相似文献
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草莓果实中S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因FaSAMS1参与草莓果实的成熟调控,但其蛋白的生物化学特性目前还不清楚。为了探讨草莓果实中FaSAMS1蛋白性质,本研究首先通过RT-PCR克隆了FaSAMS1基因的编码区cDNA序列,并成功构建了酵母表达重组载体pPICZA,进而转化酵母表达菌株X-33,最后成功诱导并纯化了FaSAMS1融合蛋白。对融合FaSAMS1蛋白的酶活性分析表明,反应体系中FaSAMS1蛋白含量为0.09mg,FaSAMS1蛋白浓度为0.454mg/mL,酶活力为0.32U,比活力为3.56U/mg,本研究为乙烯参与草莓果实成熟调控提供了生物化学证据。 相似文献
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【目的】克隆山羊甲状旁腺相关肽(Parathyroid hormone related protein,PTHrP)基因,并进行原核表达,获得具有生物学活性的融合蛋白。【方法】无菌采集山羊乳腺组织,采用TRIZOL法提取总RNA,RT-PCR克隆山羊PTHrP基因全CDs区。将山羊PTHrP基因全CDs区插入pET-32a(+)表达质粒构建pET-PTHrP质粒,经酶切和测序鉴定后,将其转化E.coliBL21(DE3)菌株,经2mmol/LIPTG、37℃诱导表达8h后,进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。【结果】获得了山羊PTHrP基因全CDs区,长534bp(GenBank登录号GU573787);酶切和测序显示,原核表达载体pET-PTHrP构建成功;SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,在E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达了pET-PTHrP融合蛋白。【结论】克隆了山羊PTHrP基因,获得了PTHrP融合蛋白。 相似文献
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【目的】获得猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂(API)基因在大肠杆菌中的最佳表达条件,为API功能研究奠定基础。【方法】以表达载体pEGX-4T-1、pET-30a及猪囊尾蚴API基因的原核表达载体pEGX-4T-1/API-Flag、pET-30a/API为材料,对影响API蛋白表达的载体(pEGX-4T-1、pET-30a)、温度(25,30,37℃)、诱导时间(2,4,6,8h)、IPTG终浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和卡那霉素终浓度(100,200,300,400mmol/L)等条件进行优化,筛选重组蛋白最佳的表达条件。对在最佳条件下获取的目的蛋白进行超声处理,4℃、10 000r/min离心分别收集上清液和沉淀,对目的蛋白进行可溶性分析;SDS-PAGE后,将目的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上,与抗His标签抗体共孵育,检测目的蛋白的反应原性。【结果】当选择pET系列载体(pET-30a)时,API表达量高于其在pGEX系列(pGEX-4T-1)中的表达量。API融合蛋白最佳表达条件为:在含200mmol/L卡那霉素的LB培养基上于37℃培养3h后,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG,再于30℃诱导培养6h。SDS-PAGE结果表明,pET-30a/API融合蛋白分子质量约为53ku,与预期蛋白分子质量一致。Western-blot检测结果显示,重组蛋白pET-30a/API能够识别特异性抗体,显示获得了大量表达正确的目的蛋白。【结论】确定了API基因的最佳表达条件,获得了较大表达量的API融合蛋白。 相似文献
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为获得乳房链球菌(Streptococcus uberis)gapC基因的原核表达载体,通过PCR方法扩增出新疆南疆地区奶牛乳房链球菌临床分离株的gapC基因,并克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a(+)-gapC,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21进行重组蛋白的表达。实验结果表明,IPTG诱导5～9 h均可获得大量重组蛋白。重组蛋白分子量约为54.0 kD,介于43 kD～66.2 kD之间,与预期大小一致,说明表达载体构建成功。通过优化最佳诱导条件,获得乳房链球菌gapC基因重组蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即可获得大量重组蛋白,为进一步确定蛋白的免疫保护性和制备疫苗奠定了基础。 相似文献
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根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,... 相似文献
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弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内的高效表达研究 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]探讨弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内高效表达的条件。[方法]通过SDS-PAGE分析,研究不同菌液密度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间对MIC3基因在大肠杆菌中表达量的影响。[结果]MIC3基因在大肠杆菌中最适表达条件为:菌液密度OD600为0.4,诱导剂IPTG终浓度为0.4mmol/L和诱导时间3.5h。在该条件下表达的融合蛋白经初步分离提纯后,1 L培养液约含融合蛋白143mg,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的49%。[结论]该研究为研究和制备弓形虫病的rMIC3诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因表达条件的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
将已构建并测序正确的含有牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的pGEX-4T—P23转化菌用IPTG进行诱导表达,经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为46．0ku的融合蛋白．根据SDS—PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件,结果显示诱导时机和时间是影响表达的主要因素,诱导温度和IPTG浓度次之;确定最佳诱导时机为转接种后2．0h,最佳诱导温度34℃,最佳诱导时间6．0h,最适IPTG浓度0．08mmol／L．表达产物主要以包涵体存在,在优化条件下融合蛋白的表达量经Bandscan5．0软件分析约占菌体总蛋白的31．7％． 相似文献
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[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础. 相似文献
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[目的]为提高植原体膜蛋白Imp基因在E.coli BL21(DE3)中的表达量,优化Imp基因的原核表达条件。[方法]通过设计正交试验,考察不同的培养条件对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-Imp的影响。在获得最佳培养条件的基础上考察不同诱导条件对Imp蛋白表达量的影响。利用SDS-PAGE和Gene Tools凝胶分析软件分析融合蛋白Imp的表达量。[结果]表达条件优化结果表明,最佳培养条件为:温度37℃,pH 7.0,装液量20%,振荡速度200 r/min;最佳诱导条件为:温度37℃,起始OD600≈1.5,IPTG终浓度0.1mmol/L,诱导培养时间6 h。[结论]在最佳条件下Imp表达量达70.98 mg/L,确定了Imp融合蛋白在大肠杆菌的优化表达条件。 相似文献