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1.
新孢子虫荧光PCR检测方法的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已知的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列,设计荧光定量PCR引物和荧光探针,经反应条件的优化,建立了检测新孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应。通过对系列稀释的重组质粒进行重复性检测,Ct值的变异系数为0.50%~1.18%。应用该方法对50份牛全血和8份流产胎儿样本进行检测,有5份全血和1份流产胎儿样本为阳性,阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7%）高。且具有较好的特异性和可重复性,可用来对新孢子虫病快速准确检测。 相似文献
2.
应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫 总被引：2，自引：1，他引：1
采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2016,(9)
为建立一种快速、敏感的弓形虫检测方法,本研究根据弓形虫GRA7基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针,建立了弓形虫荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法能特异地检测弓形虫DNA,而对新孢子虫、牛巴贝斯、马驽巴贝斯等虫DNA的检测均为阴性,具有良好的特异性;经3D数字PCR判定,其最低检测限为4.58拷贝/μL,灵敏度是常规PCR的1 000倍;重复性试验的组内、组间变异系数均小于5%;对62份疑似弓形虫感染流产的胎牛脑组织DNA进行检测,荧光定量PCR阳性检出率为24.19%(15/62),常规PCR为19.35%(12/62),阳性样品均包含于荧光定量PCR阳性样品中。本研究建立的荧光定量PCR检测方法可用于弓形虫病的早期诊断和日常监测,为监控弓形虫"带虫宿主"提供了良好的技术支持。 相似文献
4.
为建立牛新孢子虫的快速准确检测方法,根据犬新孢子虫种属特异性基因Nc-5序列,设计高度保守的引物和荧光探针,通过引物设计和搭桥PCR法扩增,获得Nc-5荧光PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测体系。该方法具有较好的特异性;可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当;通过对系列稀释的核酸样品的重复性检测,变异系数为0.50%～1.30%。通过对58份临床样品分别用该方法、不含内标的荧光PCR方法和普通PCR方法检测,结果显示,该方法与不含内标的荧光PCR方法的阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7.0%）高;表明该方法可用于临床样品中牛新孢子虫的快速检测,并能对实验室进行质量控制。 相似文献
5.
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7.
《蚕业科学》2015,(2)
为证实柞蚕热休克蛋白在柞蚕防御体系中的作用,利用RT-PCR技术在柞蚕5龄幼虫中肠组织克隆了一个热休克蛋白基因Ap HSC70(Gen Bank登录号:KJ437496),并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在感染柞蚕微孢子虫的柞蚕中肠中的表达变化。该基因的开放阅读框(ORF)长1 959 bp,编码652个氨基酸,预测蛋白质分子质量为71.49 k D,等电点(p I)为5.38,具有细胞质特征基序,推测为一种组成型热休克蛋白;Ap HSC70与斜纹夜蛾、棉铃虫同源蛋白质的序列相似度最高,分别达96.94%、96.33%。感染柞蚕微孢子虫后0~9 h的柞蚕5龄幼虫中肠组织中,Ap HSC70基因转录水平变化不大,但感染后12 h该基因的转录水平开始升高,至感染后21 h达到最高值。研究结果表明,柞蚕中肠组织的Ap HSC70基因在柞蚕微孢子虫入侵时的表达变化呈现出一定的应激响应,表达量最高可上调近5倍,推测该基因可能参与了柞蚕的免疫防御过程。 相似文献
8.
为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。 相似文献
9.
《中国兽医学报》2017,(3):443-448
利用DNAStar对GenBank上发布的鼻气管鸟杆菌(ORT)16S rRNA基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性的引物。扩增16SRNA部分保守基因序列并将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立。反应条件反复优化后,成功建立了检测ORT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对ORT的最低检测量约为100拷贝数/μL,比普通PCR高100倍;与引起禽类呼吸系统疾病的其他病原体之间无交叉反应;批内和批间试验的变异系数均小于0.63%,充分显示该方法具有良好的重复性和稳定性。对46份临床样本进行ORT检测,该方法检测的阳性样本为38份,检出率为82.26%。在38份阳性样品中,普通PCR只检出30份阳性样品,常规细菌培养只检出23份阳性样品。结果表明:本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法比其他方法更敏感,为临床上快速准确的检测、诊断禽类ORT的感染提供了敏感可靠的检测方法。 相似文献
10.
《中国预防兽医学报》2015,(12)
为评估Taq Man荧光定量PCR应用于饲料沙门氏菌检测的可行性,本研究以沙门氏菌JEO402-1基因为靶基因,并采用已建立的沙门氏菌Taq Man荧光定量PCR检测方法,进行了特异性、灵敏度、检测限等相关方法学验证。结果显示:Taq Man荧光定量PCR法特异性良好,在饲料加标样本检测中的最低检测限为2×10~(-1)cfu/m L。重复性试验表明,在不同浓度样本中的变异系数均低于1.0%,具有较高的重复性和稳定性。利用该方法和传统培养法对72份饲料样本进行检测,结果显示两种方法检测结果符合率为65.3%,Taq Man荧光定量PCR法阳性检出率比传统培养法高34.7%;传统培养法检测阳性样本,PCR法检测结果均为阳性。以上结果表明,本研究建立的Taq Man荧光定量PCR法可以应用于饲料样本的沙门氏菌检测。 相似文献
11.
为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.998 9;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×102 copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。 相似文献
12.
《中国兽医杂志》2015,(1)
根据Gen Bank中龚地弓形虫529 bp重复序列设计引物,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,常规PCR扩增出长度212 bp的特异性保守序列,将其克隆到p GEM-T Easy载体中构建重组质粒标准品;以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立弓形虫荧光定量PCR检测方法。将该方法用于临床病死猪的弓形虫检测。结果表明:用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异相关系数0.997,平均试验间变异系数2.30%,能检出约0.05个速殖子;检测弓形虫YZ-1株与YZ-2株均为阳性,而检测水牛梭形肉孢子虫、犬等孢球虫、柔嫩艾美耳球虫基因组DNA均为阴性;检测24头病死猪,弓形虫阳性率为70.8%,略高于常规PCR方法的检出率(66.7%),但检测的69个组织样品中,荧光定量PCR方法的检出率(50.7%)明显高于常规PCR方法的检出率(34.8%)。 相似文献
13.
为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法，本试验以EHV-8的全基因组序列为模板，针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列，进行对比分析，设计EHV-8的特异性引物和探针，优化反应条件，建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证，使用该方法进行临床样本检测。结果显示，建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×102 copies/μL,敏感性高；EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应，特异性强；批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示，阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见，本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求，且该方法敏感性高、特异性强、重复性好，为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。 相似文献
14.
[目的]了解新疆南疆某规模化绵羊养殖场腹泻羔羊隐孢子虫感染情况和基因亚型分布特点。[方法]采集新疆维吾尔自治区某规模化绵羊养殖场4个品种1月龄以内腹泻羔羊新鲜粪便样本60份,使用饱和蔗糖溶液漂浮法检查隐孢子虫卵囊,进行种类初步鉴定;全部粪便样本提取基因组DNA后,基于隐孢子虫SSU rRNA基因位点和微小隐孢子虫gp60基因位点,对其进行PCR扩增、测序和序列分析,鉴定隐孢子虫种属和基因亚型,构建遗传进化树解析其分子遗传特征。[结果]经显微镜观察,发现38份样本呈隐孢子虫卵囊阳性,形态学初步鉴定为微小隐孢子虫;基于SSU rRNA基因位点,采用PCR方法检测出52份样本呈隐孢子虫阳性,感染率为86.67%(52/60),经序列比对分析,均为微小隐孢子虫;基于微小隐孢子虫gp60基因位点,PCR扩增后成功获得49条序列,经比对分析均为ⅡdA19G1基因亚型。[结论]该养殖场腹泻羔羊普遍感染微小隐孢子虫,其基因亚型均为ⅡdA19G1。调查结果为新疆南疆绵羊隐孢子虫种属鉴定与遗传进化研究提供了基础数据。 相似文献
15.
16.
家蚕微孢子虫PCR检测的研究 总被引：8，自引：5，他引：3
根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。 相似文献
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鸭疫里默氏杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank登录的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白(OmpA)基因保守区序列,设计引物和探针,建立了直接检测鸭疫里默氏杆菌的实时荧光定量PCR快速方法。10倍梯度稀释RA菌株制备DNA模板测定方法的灵敏度,结果可在8.0×103CFU/mL浓度下特异地检测出目的菌,最低能检测到RA的DNA模板为8.0拷贝/μL;对鸭源大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌进行检测,结果均为阴性,建立的实时荧光定时PCR方法特异性强。用RA菌株人工感染雏鸭,感染后定时采集咽喉拭子、泄殖腔拭子、心血、肝脏、肺脏、脑,分别用实时荧光定量PCR检测,对脏器进行病原菌分离。结果表明,1/10半数致死量接种组,感染后8 h从心血、肝脏、脑组织检测到RA核酸,16 h后全部试样呈阳性;24 h首先从肝脏分离到RA,心血、肝脏、肺脏、脑组织均分离出RA。心血和脏器RA实时荧光定量PCR阳性检出率为63.8%(51/80),RA分离率为28.8%(23/80)。10个半数致死量接种组,1 h即可从咽喉拭子、心血和肝检测到RA核酸,5 h全部样品为阳性;5 h从肺和脑分离到RA。RA人工感染鸭的心血、肝脏、肺脏、脑实时荧光定量PCR阳性检出率为86.3%(69/80),RA分离率为60%(48/80)。用加热裂解法提取样品RA DNA只需30 min,建立的实时荧光定量PCR检测RA只需2 h,适用于RA的快速诊断、流行病学调查、种鸭引进隔离检疫、活鸭及其产品国内市场和进出口检验检疫。 相似文献
18.
基于为蚕种生产与流通贸易提供快速、灵敏、准确检测家蚕微孢子虫的方法,以家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因66 bp片段作为靶标,设计特异性引物和TaqMan探针,用构建的重组质粒制备标准品进行荧光定量PCR扩增,通过优化PCR反应体系,测定线性范围,评价方法的特异性、灵敏度和重复性,成功构建了家蚕微孢子虫的荧光定量PCR检测方法,并研制出诊断试剂盒。该方法的检测线性范围为1×108～1×102拷贝/mL的7个线性梯度,检测家蚕微孢子虫的敏感度达1×102拷贝/mL,特异性高,3次重复性检测应用试验的批内变异系数为3.6%～7.2%,批间变异系数为5.2%～7.8%。结果表明,建立的家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法具有准确、灵敏、快速、特异性强的特点。 相似文献
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参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒(atypical porcine pestivirus virus,APPV)全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模板优化反应条件,建立了检测APPV的特异性荧光定量PCR方法。结果显示,建立的荧光定量PCR方法C_t值与标准品在1.49×10~1～1.49×1010 copies/μL呈现良好的线性关系,相关系数为R^20.999,斜率为-3.442,扩增效率为95.207%。该方法与PCV2、PRV、PRRSV、PPV及CSFV基因组均无交叉反应,敏感性比常规PCR高出1 000倍,组内和组间重复试验变异系数均小于2%。对临床采集的20份疑似感染APPV的样品进行检测,结果显示应用所建立的荧光定量PCR成功检测到3份APPV阳性样品,而常规PCR仅检测到1份,表明所建立的荧光定量PCR比常规PCR灵敏度更高。本试验所建立的APPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,可实现对APPV早期诊断及感染进行定量分析检测。 相似文献