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乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是生物体内保证神经信号正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标。现研究拟采用发酵罐培养含pET-30a/ace的表达菌株E.coli BL21(DE3),大量表达纯化螨AChE,利用单因素试验和正交试验优化AChE活性的测定条件。结果表明:发酵培养的重组菌株大量表达约为68kD的朱砂叶螨AChE蛋白。底物浓度、温度、pH和酶浓度等各测定因素对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性存在显著影响。确定朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性测定的最佳反应条件为:底物浓度1mmol/L,pH值7,温度35℃,酶浓度0.5mg/mL。通过体外发酵培养纯化获得了大量的朱砂叶螨AChE重组蛋白,确定了螨AChE活性测定的最佳条件,为进一步研究其酶学性质以及AChE抑制剂的体外筛选奠定基础。 相似文献
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[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础. 相似文献
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[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。 相似文献
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[目的]构建含G FP-LC3B基因的真核表达载体.[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到cDNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pcDNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pcDNA3.1-GF载体上,得到cDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体.[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体cDNA3.1-GFP-LC3B.[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础. 相似文献
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为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。 相似文献
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[目的]为研究对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白与虾细胞之间的作用机制奠定基础。[方法]采用PCR扩增方法构建含白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的真核表达重组载体pcDNA3.1（＋）-vp28,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染到293T细胞中,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。[结果]VP28的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现出1条634bp左右的条带,与GenBank中vp28的序列完全一致。对pcDNA3.1（＋）-vp28转染后的阳性单克隆菌落进行PCR鉴定、扩大培养和质粒提取,并对所得质粒进行HindⅢ和BamⅢ双酶切,获得了5409和610bp左右的2条带,与预期结果一致;所获扩增产物与vp28序列完全一致,说明重组质粒pcDNA3.1（＋）-vp28被成功转染到293T细胞中;SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中的表达产物与预期结果相符。[结论]pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中可成功表达VP28。 相似文献
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为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%。表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外。 相似文献
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猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。 相似文献
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目的构建并检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）真核表达重组质粒。方法提取肾组织RNA进行逆转录,扩增GPC3基因的编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定并测序;将克隆成功的质粒转染至Huh7细胞,用荧光定量PCR和Western blot检测GPC3的表达水平。结果成功扩增GPC3编码区,并克隆至载体pcDNA3.1中;GPC3过表达载体转染至Huh7细胞后,荧光定量PCR和Western Blotting检测结果显示GPC3mRNA和蛋白表达水平均明显增加。结论成功构建GPC3过表达载体可用于后续研究。 相似文献
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利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。 相似文献
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为得到TAT-Apoptin 融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin 为模板PCR 扩增出TATApoptin
基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin 蛋白进行表达。PCR
和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋
白能与Apoptin 多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin 基因原核表达载体构建成
功,并能在Rosetta 中进行分泌性表达。 相似文献
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DNA甲基化在基因表达调控过程中发挥重要作用,甲基结合蛋白(Methy1-Binding Domain Protein, MBD)是能特异识别甲基化位点的反式作用因子.开展植物MBD基因的功能研究对于探讨植物生长发育的表观遗传学调控机制具有重要意义.该研究构建了小麦甲基结合蛋白基因MBD3的原核表达载体pGEX-4T-MBD3,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株,在37℃,lmMIPTG浓度条件下,成功诱导表达了的GST-MBD3融合蛋白,大小为49.6kDa,这为进一步开展MBD3的蛋白纯化和功能分析奠定了基础. 相似文献
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植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H+,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。 相似文献
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采用基因克隆的方法构建人白细胞介素(hIL-24)基因的原核表达载体pET-28a(+)-hIL24,在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白rhIL-24,SDS-PAGE和Western blotting分析蛋白表达,探讨其最佳诱导表达条件.结果表明:hIL-24基因的表达产物分子质量约25 ku,且以包涵体的形式存在于超声裂解后的沉淀中,重组蛋白rhIL-24可特异性被鼠抗人IL-24单克隆抗体识别.当IPTG终浓度为0.5 mmol·L~(-1)、37℃诱导8 h时,其表达量最高.hIL-24基因在该原核表达系统中的成功表达,为其生物学功能的研究奠定了基础. 相似文献
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为建立硫化物醌氧化还原酶(SQR)的肠道定向表达载体,同时通过转染小鼠肠道上皮细胞确定载体的有效性,本试验采用重叠PCR、中间载体法、酶切连接法获得重组载体,通过脂质体转染法将重组载体转入小鼠肠道上皮细胞,并鉴定重组载体的特异性表达。结果显示,成功构建了以肠脂肪酸结合蛋白质(IFABP)为启动子的SQR肠道定向表达载体pc DNA3.1(-)-IFABP-SQR-GFP,并在小鼠肠道上皮细胞中检测到表达的融合绿色荧光蛋白质(GFP)。表明IFABP启动子能够在肠道细胞中定向启动SQR的表达。 相似文献
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