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杆状病毒(Baculovirus)是昆虫专一性的病原病毒,是目前为止发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒.杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)是一个以杆状病毒为外源基因载体,昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统. 相似文献
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快速稳定地将外源基因插入杆状病毒基因组获得重组杆状病毒,是提高昆虫杆状病毒表达系统应用效率的关键技术之一。在Ac Bacmid的基础上,通过λRed同源重组技术敲除病毒基因组lef2和orf1629基因的3'端部分序列获得RDAc Bacmid-DualKo,并用Bsu36Ⅰ线性化之后,经重叠PCR获得5'端和3'端各含有50 bp同源臂及以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为外源基因的表达盒片段,再将线性化杆状病毒载体片段与表达盒片段共转染sf9细胞,3~4 d即可获得重组杆状病毒rvAcBacmid-GFP。SDS-PAGE和Western blot结果表明,被rvAcBacmid-GFP感染的sf9细胞能高效表达绿色荧光蛋白。该方法通过线性化复制缺陷型杆状病毒载体和携带有同源臂及外源基因的重叠PCR片段,在胞内完成同源重组获得重组杆状病毒,避免了繁琐的病毒空斑纯化和分子克隆操作,获得的重组杆状病毒中无不稳定因子BAC及影响下游应用研究的抗性基因,为快速构建重组杆状病毒高效表达外源基因及相关研究应用提供了新的技术平台。 相似文献
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杆状病毒表达系统及其表达传染性法氏囊病病毒基因研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
介绍了杆状病毒表达系统及其优点。简述了以杆状病毒为载体在昆虫细胞中高效表达传染性法氏囊病病毒基因的研究进展。该系统的表达产物具有高效多用、安全可靠及成本低廉等特点，认为以杆状病毒表达系统生产传染性法氏囊病病毒基因工程苗具有广阔的应用前景。 相似文献
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根据BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的供体质粒，设计表达引物，从克隆质粒上扩增本地毛形线虫（Trichinella nativa）49kuES结构蛋白基因TNPG，酶切后与供体质粒连接，在大肠杆菌中克隆，将克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态菌，该菌含有杆状病毒穿梭载体，供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下，通过转座而插入杆状病毒基因组中，筛选含有重组质粒的BacmidDNA，用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒。SDS-PAGE电泳显示表达蛋白为36ku的融合蛋白，Westernblot检测表明表达的融合蛋白能够被小鼠旋毛虫的阳性血清识别。实验结果表明，本地毛形线虫的ES融合蛋白的制备将在诊断方法的建立和免疫研究方面具有很好的应用前景。 相似文献
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家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV）是一种杆状病毒，而P10基因是杆状病毒的一种晚期高交表达基因。为了进一步了解P10基因在家蚕作为外源表达载体中的作用，现对国内外在BmNPV的P10基因方面的研究进行综述，以提高对P10基因的应用。 相似文献
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<正> 蓖麻蚕核型多角体病毒(NPV)是杆状病毒典型代表之一。建立蓖麻蚕NPV-昆虫细胞系统,对于研究病毒的增殖规律,阐述基因表达与调控等基础理论研究具有重要价值。特别是杆状病毒载体系统已成为杆状病毒分子生物学研究领域的热门课题。国内已开始构建蓖麻蚕NPV表达载体,期望在细胞和活体水平表达外源基因。因此,选择和建立适宜的病毒宿主离体系统,有利于蓖麻蚕NPV作为载体的 相似文献
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昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望 总被引：10，自引：0，他引：10
昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转译后加工修饰,容易从无血清培养上清中纯化,无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展:高强度早期启动子群杆状病毒转移载体的成功合成,以扩大寄主范围和增进重组蛋白稳定性为目的的亲本病毒的改造;通用的昆虫细胞培养基配方的不断优化,特定昆虫细胞株培养基的研制和适用于大规模悬浮培养的无血清培养基的商品化;旨在进行复杂糖基化及提供相对稳定细胞环境的宿主细胞工程;以新标记物(tag)载体和相关亲和层析方法为代表的蛋白质高效纯化方法的进步。昆虫杆状病毒表达载体系统在基础研究、医药卫生和农业上具有广阔的应用前景。 相似文献
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杆状病毒表达载体系统研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
杆状病毒(Baculovirus)是一类超大双链环状DNA分子(约135kbp),因其成员的病毒体呈杆状而得名.这类病毒主要见于昆虫体内,是已知昆虫病毒中类群最大、发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒.其代表型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus,AcMNPV)研究得最为深入.80年代初,国外学者发现多角体蛋白基因(polh)的强启动子及晚期大量表达的特性,Smith等首次建立了AcMNPV/秋黏虫细胞(spodoptera frugiperda,sf)表达系统,表达了人β干扰素.从此,以杆状病毒作为载体,在昆虫细胞或虫体内表达外源基因,形成了昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System,BEVS).早期的BEVS有很多不足,如重组率较低、筛选困难、操作周期长、产物不易纯化等.短短20多年时间里,随着杆状病毒分子生物学研究的不断深入,杆状病毒表达系统迅速发展,不断完善,已成为当今基因工程领域四大表达系统之一,在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能分析及各种生物活性物质的制备等方面发挥着越来越重要的作用. 相似文献
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应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因 总被引：3，自引：0，他引：3
将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。 相似文献
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提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平的技术 总被引：1，自引：0，他引：1
昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而,由于各种因素重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平。提高重组蛋白的表达水平成为提高昆虫杆状病毒表达系统效率的核心问题。根据目前的研究,提高外源基因表达水平的技术主要包括抑制目的蛋白降解、合理调控目的基因的转录、优化启动子类型以及利用活体昆虫而非培养细胞,如用家蚕幼虫或蛹进行表达等。这些技术也为家蚕成为更加高效的生物反应器奠定了基础。 相似文献
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本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见. 相似文献
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昆虫杆状病毒的生活史中令人惊奇的现象之一是其极晚期基因多角体蛋白(polyhedrin, polh)基因的超高水平表达,表达产生的多角体蛋白将病毒粒子包埋到内部形成包涵体。本文根据已有的研究结果,从3个方面概括了polh基因超高水平表达的机制,即polh启动子的结构特征和转录调控、polh mRNA的结构和翻译调控以及影响polh基因表达的蛋白调控因子,期望有助于更好地理解polh超高水平表达调控的分子机制,为提高杆状病毒表达载体系统表达外源蛋白效率提供理论指导。 相似文献
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通过RT-PCR获得赤羽病毒（AKAV）OBE-1株的Gl基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭我体Bacmid DNA同源重组,获得了重组杆状病毒DNA,用CELLFECTIN介导其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BAC-G1P1。SDS-PAGE结果表明,感染BAC-GIP1后的Sf9昆虫细胞表达可溶形式的120ku目的蛋白,其大小与预期相符。Western blot和间接免疫荧光试验显示表达产物具有良好的免疫学活性。 相似文献
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传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达 总被引：11，自引：1，他引：10
将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。 相似文献
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利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。 相似文献