猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定     

邵淑玉  李佳  马卓  于畅  张莹  张金龙  马志禹 《中国畜牧兽医》2022,49(10):3756-3763

【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×10⁶ TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。  相似文献   

奶牛溶菌酶基因原核表达载体的构建     

李云龙  高峰  张海涛  顾开朗 《黑龙江畜牧兽医》2018,(5)

为了构建奶牛溶菌酶(lysozyme,LYZ)原核表达载体,试验人工设计并合成LYZ基因CDS序列,将其克隆至表达载体p ET32T,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定。结果表明:PCR扩增和双酶切产物的分子质量分别为1 000 bp和400 bp,与预期大小一致;扩增产物经测序鉴定,也与目的片段完全一致。说明原核表达载体LYZp ET32T构建成功。  相似文献   

猪NMB基因过表达载体的构建及其在猪睾丸间质细胞中的表达     

王小雨  何丹  孙月  於惠娴  马卓  于畅  马志禹 《黑龙江畜牧兽医》2022,(17):74-78+141-142

为了构建猪神经介素B(pNMB)基因慢病毒过表达载体,以及研究其在猪睾丸间质细胞中稳定表达情况,试验采用RT-PCR方法扩增获得pNMB基因的CDS序列,插入到pMD-19T载体中,构建pMD19-T-pNMB重组质粒,对该重组质粒和慢病毒过表达质粒pCD513B-1进行双酶切,以获得的线性化pCD513B-1和线性化pNMB质粒构建pCD513B-1-pNMB重组慢病毒过表达载体;将重组慢病毒过表达载体pCD513B-1-pNMB和辅助质粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)共转染至HEK293T细胞中,包装获得pNMB过表达慢病毒,并用倍比稀释法测定病毒含量;用pNMB过表达慢病毒转染猪睾丸间质细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达的细胞,利用实时荧光定量PCR方法检测pNMB mRNA的表达情况。结果表明：RT-PCR扩增获得大小约为366 bp的目的片段,与GenBank中pNMB基因的CDS序列完全一致,RT-PCR扩增片段与目的片段序列完全相同;将pNMB基因克隆到pMD-19T载体中,成功构建出pMD19-T-pNMB重组质粒;XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒p...  相似文献   

伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

胡涛  崔保安  王岩  祁小乐  王丽娟 《中国预防兽医学报》2004,26(1):25-27

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.对重组质粒PGTE-gD进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性.测序结果表明目的片段包含一个1203bp的开放性阅读框(ORF),编码400个氨基酸组成的多肽.将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pcDNA-gD,为下一步基因免疫奠定了基础.  相似文献   

猪伪狂犬病病毒粤A株gE基因的克隆与鉴定     

耿忠海  贺东生  罗满林  黄毓茂  刘镇明  陈征 《广东畜牧兽医科技》2005,30(2):41-42

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株进行了PCR扩增,PCR产物克隆到pMD18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实已克隆到PRV粤A株的gE全基因。  相似文献   

绵羊DRA基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定     

许万云  王会敏  汪文伦  胡梦薇  严国  李建华  高剑峰 《中国畜牧兽医》2016,43(3):568-576

根据绵羊DRA基因序列和酿酒酵母表面展示载体pYD1上的多克隆位点设计特异性引物,从绵羊组织中提取总RNA并逆转录,利用PCR技术扩增得到DRA基因,克隆获得762 bp目的片段,并提交GenBank,登录号:KR422362。将该基因通过双酶切连接到表面展示载体pYD1 上,成功构建了酿酒酵母表面展示重组质粒pYD1-DRA。将DRA基因外显子2两端进行基因点突变,形成新的酶切位点,继而对外显子2设计特异性引物,对绵羊大样本进行DNA池化,并将外显子2扩增产物测序,分析其多态性获得多态位点。重组质粒双酶切得到246 bp具有多态性的外显子2,将其连接到经同样酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRA-TB上,成功构建了酿酒酵母表面展示库。将其转化用于表面展示的酿酒酵母EBY100感受态细胞中,得到酵母转化子,挑取酵母菌的单克隆通过PCR 扩增及序列测定证实了DRA基因库已成功整合到酿酒酵母基因组中。经半乳糖诱导后,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测得到DRA基因库已成功展示在酵母细胞表面。  相似文献   

小鹅瘟病毒山东株的分离鉴定及VP3基因序列分析     

靖吉强  武世珍  李舫  刁有祥  纪巍 《畜牧与兽医》2009,41(8)

从山东某患病鹅群中分离到一株病毒。根据小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因全序列,设计了一对特异性引物,提取病毒DNA进行PCR反应,成功扩增出372 bp的特异条带。将PCR产物纯化后,与pMD18-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后,对阳性克隆进行测序。测序结果表明该小鹅瘟病毒毒株的VP3基因片段与GenBank已公布的GPV相应序列的同源性在94.1%~98.4%之间。  相似文献   

斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法的建立     

王娜  张旻  景宏丽  江育林  吴绍强 《畜牧与兽医》2018,(5)

旨在建立一种基于PCR的焦磷酸测序检测方法,用于斑点叉尾鮰病毒病的快速检测和确诊。针对斑点叉尾鮰病毒(CCV)蛋白激酶(PK)基因的保守区域设计扩增引物与测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,借助测序结果比对确定是否为CCV核酸序列。通过对反应条件与体系的优化,成功建立了CCV PK基因焦磷酸测序检测方法。结果表明:建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为144 bp,能够特异性检测出目的病毒,最低核酸检测限为5×10-6ng/μL,重复测序3次均能准确测出45 bp核酸序列。本研究建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适合高通量检测且耗时短仅需4 h,为CCV的快速检测提供了一种可行方法。  相似文献   

禽流感病毒M2蛋白跨膜区基因的缺失   总被引：5，自引：1，他引：5  

李永清  姚四新  韦莉  杨汉春 《中国兽医杂志》2004,40(5):6-9

根据禽流感病毒 (AIV ) A/ Chicken/ Korea/ MS96 / 96 (H9N2 )株的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过 RT- PCR,从AIV H9N1株感染的 MDCK细胞总 RNA中扩增出 2 94 bp的 AIV全长的 M2基因。通过软件分析其序列中的跨膜区后 ,将其与p GEM- T easy载体连接产物 p GEM- T/ M2为模板 ,通过 PCR扩增出约 90 bp左右 M2的膜外区编码序列和约 16 0 bp左右 M2的胞内区编码序列。将两个扩增产物同时作为模板 ,以 OE- PCR(overlap extension- PCR)扩增出约 2 5 0 bp的缺失跨膜区的 M2基因M2 d。测序结果表明 ,M2 d的序列除在跨膜区以 4个甘氨酸序列替代外 ,其余部分与 M2完全一致 ,由此说明 OE- PCR扩增法成功地将禽流感病毒 M2基因跨膜区缺失  相似文献   

努比亚山羊LMCD1基因生物信息学分析、真核表达载体的构建及表达     

邹剑伟  邹菊红  申玉建  韦一  张叁保  连子童  徐建建  宋颖  黄艳娜  韦英明  蒋钦杨  郑自华 《中国畜牧兽医》2022,49(6):2033-2042

【目的】 扩增努比亚山羊LIM结构域基因1（LIM domain gene 1,LMCD1）并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测LMCD1基因的表达情况,为研究努比亚山羊LMCD1基因功能及探究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的作用提供依据。【方法】 从努比亚山羊背最长肌组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增LMCD1基因CDS区序列,并进行生物信息学分析;将LMCD1基因以同源重组的方式连接pEGFP-N1载体,经酶切、测序鉴定后重组阳性质粒命名为pEGFP-N1-LMCD1;将pEGFP-N1-LMCD1重组质粒转染至山羊骨骼肌卫星细胞,通过实时荧光定量PCR检测努比亚山羊LMCD1基因的表达情况。【结果】 努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列全长1 092 bp,编码363个氨基酸。LMCD1蛋白分子式为C₁₇₇₅H₂₈₁₈N₅₀₈O₅₃₃S₂₉,分子质量为40.73 ku。努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列与山羊相似性最高（99.8%）,与斑马鱼相似性最低（55.4%）,与其他物种的相似性在87.0%~98.8%之间。LMCD1蛋白无信号肽,不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。通过构建努比亚山羊pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体并转染至骨骼肌卫星细胞,过表达LMCD1基因,产生绿色荧光信号。【结论】 试验成功扩增LMCD1基因CDS区序列,构建了pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体,并分析了生物学功能,为后续开展LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的机制研究提供了理论基础。  相似文献   

Construction and Identification of Lentiviral Overexpression Plasmid of Mouse Zbtb38 Gene     

LI Jie  CHEN Jing  YANG Fan  LI Jun  CAI Yafei 《中国畜牧兽医》2007,47(10):3088-3094

This study was conducted to construct zinc finger and BTB domain containing 38 (Zbtb38) gene lentiviral overexpression plasmid vector.Firstly,the CDS sequence of mouse Zbtb38 gene was amplified by overlap extension PCR method using mouse spinal cord tissue,and the Zbtb38 CDS sequence front amplification primer 1 and the latter amplification primer 2 were designed respectively.Using the amplification products of the above two primers as template,primer 3 was designed and subjected to fusion PCR amplification,thereby obtaining the full CDS sequence of Zbtb38.Then,the obtained Zbtb38 gene CDS full sequence was ligated to the plasmid pGM-T,and the recombinant plasmid was transferred into E.coli DH5α competent cells,the positive clones were identified and verified by direct PCR and sequencing.Finally,the Zbtb38 CDS sequence was ligated into the lentiviral vector Plvx-puro by XhoⅠ and BamHⅠ double digestion to obtain the shuttle plasmid Plvx-puro-Zbtb38,which was co-transfected with lentiviral packaging plasmids to produce lentiviral particles in 293T cells.The results showed that the primer 1 amplification product contained the first 1-1 794 bp of the Zbtb38 CDS sequence,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 772 bp.The primer 2 amplification product contained the 1 762-3 594 bp of the entire sequence of Zbtb38 CDS,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 818 bp,indicating that the fragmented amplification target fragment was successfully obtained.The expected fusion products amplified by primer 3 and the PCR amplification products of the colonies both contained the complete sequence of Zbtb38 CDS (3 594 bp),which was compared with the CDS sequence of Zbtb38 gene in NCBI database,and the coincidence rate was 99.99%,indicating that the Zbtb38 CDS sequence was successfully amplified.The Real-time PCR results showed that the virus titer reached 3.25×10⁸ Tu/mL,which met the experimental animal injection standard requirement,indicating that the lentiviral vector was successfully constructed.In summary,the mouse Zbtb38 gene lentiviral overexpression plasmid vector was successfully constructed in this experiment.  相似文献   

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建     

蒋成砚  谢昆  罗家琴  柴俊  王生奎  张以芳 《中国畜牧兽医》2011,38(4):121-123

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。  相似文献   

Construction and Identification of Yeast Surface Display Libraries of Ovis aries DRA Gene Exon 2     

XU Wan-yun  WANG Hui-min  WANG Wen-lun  HU Meng-wei  YAN Guo  LI Jian-hua  GAO Jian-feng 《中国畜牧兽医》2016,43(3):568-576

The specific primers were designed according to Ovis aries DRA gene sequence deposited in GenBank and the multiple cloning site of the plasmid pYD1,which was a vector used for protein surface display on Saccharomyces cerevisiae.The gene encoding DRA was amplified by PCR using the genomic RNA of Ovis aries.The 762 bp fragment was cloned and released in GenBank and registration number was KR422362.The PCR product was inserted into the yeast surface display plasmid vector pYD1 by double enzyme digestion.It was indicated that DRA gene was successfully integrated into the genome.Dot mutation was made at both ends of exon 2 in DRA gene for making restriction enzyme cutting site and design the exon 2 specific primers according to mutated Ovis aries DRA gene sequence.Sequenced exon 2 amplification products based on DNA pooling of sheep large sample template was analyzed the polymorphic loci.The polymorphic exon 2 246 bp fragment was obtained by double enzyme digestion and connected to surface display restructuring mutation carriers pYD1-DRA by the same double enzyme digestion,and then we successfully constructed yeast surface display libraries.We transformed it into Saccharomyces cerevisiae EBY100 cell.Yeast monoclone was identified by PCR amplification and sequencing,and we confirmed that DRA gene had been integrated into Saccharomyces cerevisiae genome.After galactose induced,it was detected that DRA gene library had been successfully demonstrated on the yeast cell surface under the fluorescence microscope by immunofluorescence method.  相似文献   

奶牛NR1D1基因的真核表达载体构建、表达谱及其在卵巢组织的定位     

王逸群  刘祖培  李雅婷  张海森  李丹  靳亚平  陈华涛 《畜牧兽医学报》2023,54(1):133-145

旨在克隆奶牛核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)基因的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体，预测分析NR1D1基因的生物学功能，并检测该基因的组织表达谱及其在卵巢组织的表达分布。本研究以5头健康的24月龄雌性奶牛为试验动物，PCR扩增带有同源臂的奶牛NR1D1基因CDS区全长片段，利用同源重组法将目的片段连接至线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA空载体，构建重组质粒，利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定。结合质粒测序结果，利用生物信息学软件预测分析该基因的生物学功能。将鉴定正确的质粒转染至HEK293T细胞，利用实时荧光定量PCR(qPCR)与Western blotting技术检测NR1D1基因在mRNA与蛋白水平的表达。此外，利用qPCR检测奶牛NR1D1基因的组织表达谱，并利用免疫组织化学技术检测NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的表达分布。结果，成功获得带有同源臂的奶牛NR1D1基因的CDS区全长片段(1 884 bp),酶切、PCR及...  相似文献   

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析     

赵泓淙  高登科  江海圳  李雅婷  李丹  马白荣  靳亚平  陈华涛 《中国畜牧兽医》2021,48(12):4327-4338

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。  相似文献   

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达     

康文玉徐自忠  花群义杨云庆  周晓黎董俊  尹尚莲高洪 《中国兽医科技》2006,36(6):454-459

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原，根据其基因序列设计合成了1对特异性引物，对CaPVP32基因进行了PCR扩增，产物大小约为969bp；产物回收纯化后，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞，与已报道的多株CaPVP32基因序列的同源性高达99％；相应地，氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆，该重组菌株经L—arabinose诱导，可稳定、高效地表达CaPVP32抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约51．53ku．  相似文献   

小尾寒羊SPARCL1基因编码区克隆及表达分析     

肖成  金海国  魏天  高一  于永生  张立春  马惠海  曹阳 《中国畜牧兽医》2019,46(12):3466-3474

为了探究小尾寒羊富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似物1（secreted protein acidic and rich in cysteine like 1,SPARCL1）基因结构及其各组织间表达差异,试验提取小尾寒羊肝脏组织总RNA,根据GenBank中公布的绵羊SPARCL1基因序列设计引物,应用PCR技术扩增SPARCL1基因编码区（CDS）。将扩增产物连接到pMD18-T载体进行测序,获得小尾寒羊SPARCL1基因完整CDS区序列信息,应用生物信息学软件分析序列及蛋白结构。以小尾寒羊心脏、肝脏、肌肉、胃、十二指肠、小肠组织mRNA为模板,通过实时定量荧光PCR技术检测SPARCL1基因在小尾寒羊各组织间的表达差异。结果显示,试验成功获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS 1 962 bp,编码653个氨基酸;分子质量为74.39 ku,理论等电点为4.64,为亲水性蛋白质;SPARCL1基因具有信息肽切割位点,为分泌蛋白;小尾寒羊SPARCL1基因序列与NCBI中绵羊序列同源性为99.80%,SPARCL1基因CDS区出现4处突变位点,但未引起氨基酸改变;SPARCL1蛋白存在77个蛋白磷酸化位点和3个糖基化位点;SPARCL1蛋白表达预测主要定位在细胞质;SPARCL1蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别占31.9%、6.4%、28.7%和33.0%,三级结构预测结果与其一致。SPARCL1基因在小尾寒羊皮下脂肪组织中相对表达量明显高于其他组织。本研究成功克隆获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS区完整序列,并对其序列、蛋白理化特性、结构及各组织间表达差异进行了详细分析,为研究小尾寒羊SPARCL1基因功能,探究其在小尾寒羊脂肪代谢过程中可能发挥的作用提供参考依据。  相似文献