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旨在建立鸡骨骼肌卫星细胞（muscle satellite cell,MSC）体外分离、培养、纯化、诱导分化及鉴定的方法。选取12胚龄SPF鸡胚,综合松散肌肉纤维和游离纤维基质层细胞等原理,对分离细胞使用的酶以及后续的细胞纯化、诱导分化方法进行优化;并从形态学、细胞分化能力、生长曲线、免疫荧光、RT-PCR等方面对MSC进行鉴定,从而提出一种鸡骨骼肌卫星细胞的混合酶消化分离培养方法。结果表明,刚分离纯化后的细胞折光性强,24 h贴壁展开后呈纺锤状;待诱导分化后能形成排列整齐的多核肌管;CCK-8测定细胞生长曲线呈典型的“S”型;优化后,细胞存活率为（90.82±1.294）%,细胞纯度为（90.44±1.264）%;免疫荧光检测标志性基因Pax7、Desmin表达阳性;RT-PCR检测标志性基因Pax7、MyHC、MyoD1呈阳性;并且分化前标志性基因Pax7表达量是分化后的1.705倍,分化后期标志性基因MyHC表达量是分化前的13.073倍。该试验建立了一种快速简便的鸡骨骼肌卫星细胞的体外培养方法,为研究鸡骨骼肌细胞生物学机制、肉鸡品种优化、细胞移植修复提供良好的细胞模型。 相似文献
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旨在探究民猪脂肪细胞分化过程中产热基因和米色脂肪标记基因的表达变化规律，为进一步研究民猪脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制提供依据。本研究采集1月龄民猪的背部脂肪组织，分离前体脂肪细胞进行培养及成脂诱导，观察分化过程中细胞形态并进行油红O染色鉴定；检测产热基因UCP3、PGC-1α、PPARα和米色脂肪标记基因EBF2、CD81、PDGFRα在诱导分化第0、2、4、6、8天的表达量。结果表明，随着诱导分化的时间增加，细胞中的脂滴逐渐增多，在分化第8天时进行油红O染色，多数细胞达到成熟脂肪细胞阶段。以第0天为对照，PGC-1α、EBF2、PDGFRα在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且达到最高，第4、6、8天呈下降趋势。UCP3在第4、6、8天表达量极显著升高（P<0.01），第8天有所下降。PPARα和CD81在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且在第4和6天表达量与第2天相比变化不大。综上表明，本研究成功进行了民猪前体脂肪细胞的成脂诱导分化，揭示了分化过程中产热和米色脂肪标记基因的表达规律，为进一步研究民猪前体脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制和民猪抗寒能力奠定基础。 相似文献
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本研究旨在建立西门塔尔牛牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）体外分离培养体系，并对其生物学特性进行探讨，为细胞治疗、再生医学等提供种子细胞。取14周龄西门塔尔牛牙龈，采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法分离GMSCs，进行体外培养和冷冻保存，测定冻存前后细胞活率，MTT检测法绘制GMSCs生长曲线；通过免疫荧光、流式细胞术和PCR等方法鉴定西门塔尔牛GMSCs特异性标记物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和STRO-1），并通过体外成脂、成骨诱导检测其多向分化潜能。结果表明，西门塔尔牛GMSCs折光性强、贴壁后呈长纺锤形；冻存前和复苏后细胞的活率检测结果显示，细胞复苏后的活率均小于冻存前的活率，但均维持在85%以上，细胞生长曲线呈典型的"S"型；免疫荧光结果显示，西门塔尔牛GMSCs表达CD29、CD105和STRO-1，不表达CD31；PCR结果显示，西门塔尔牛GMSCs表达CD44、CD73、CD90和CD166，不表达CD34和CD45；流式细胞术结果显示，西门塔尔牛GMSCs高表达CD73（99.94%）、CD90（99.87%）和CD105（99.90%），几乎不表达CD34（1.16%）和CD45（1.18%）；成脂诱导分化后，可见大小不一的脂滴，脂滴可被油红O染色，且PCR检测结果表明其表达成脂关键基因过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（PPAR-γ）和脂蛋白酶（LPL）；成骨诱导分化后，可见被茜素红染色的矿化结节，且PCR检测结果表明其表达成骨关键基因Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）和骨桥蛋白基因（OPN）。综上，本研究成功分离出西门塔尔牛GMSCs，建立了西门塔尔牛GMSCs体外分离、培养体系，并通过成脂和成骨诱导分化证明其具有多向分化潜能，结果可为再生医学和牙齿修复等研究提供参考。 相似文献
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旨在探究肌球蛋白结合蛋白C1（myosin binding protein C1,MyBPC1）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究MyBPC1在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。本研究利用西门塔尔胎牛原代牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型模拟牛骨骼肌的生长发育过程。采用qRT-PCR和Western blot检测MyBPC1的细胞时序表达谱。试验分为两组。在RNA水平每组4个重复,每个重复20 μL;在蛋白水平每组3个重复,每个重复15 μg。采用qRT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞转染MyBPC1的过表达效果,并进一步检测细胞增殖期标志因子Pax7、Ki67以及细胞分化期标志因子MyHC、MyOG的表达变化情况,观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态。结果,MyBPC1在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在极显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后MyBPC1的mRNA和蛋白表达量均极显著高于增殖期（P<0.01）。过表达MyBPC1后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,增殖标志因子Pax7的mRNA水平和蛋白表达水平无显著差异,分化标志因子MyHC的mRNA水平和蛋白表达水平极显著高于对照组（P<0.01）。过表达MyBPC1可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化,为进一步开展MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞的调控机制奠定基础。 相似文献
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试验旨在分离绵羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells，SMSCs），建立绵羊SMSCs体外分离、培养及鉴定体系，为后续研究提供种子细胞。以新生健康绵羊为试验动物，采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步酶消化法和差速贴壁法分离并纯化SMSCs。用RT-PCR和免疫荧光法鉴定SMSCs标记基因配对盒基因7（paired box 7，Pax7）、结蛋白（Desmin）和生肌调节因子1（myogenic regulatory factors 1，MyoD1）的表达情况；用血清撤离法诱导SMSCs向成肌细胞方向分化，成肌诱导后观察肌管的形成，免疫荧光法检测成肌分化特异性标志肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）的表达。RT-PCR结果显示，扩增条带与预期相符，所分离细胞表达SMSCs标记基因Pax7、Desmin和MyoD1；免疫荧光鉴定结果显示，所分离细胞表达SMSCs标记蛋白Pax7、Desmin和MyoD1；成肌诱导后镜下可见细胞相互融合形成多核的肌管，并表达成肌特异性标志MHC。本试验分离了绵羊SMSCs，建立了适用于绵羊SMSCs的体外培养体系，并成功进行了成肌诱导分化，为今后研究绵羊骨骼肌生长发育机制提供了试验材料和技术支撑。 相似文献
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【目的】 探究对牛骨骼肌发育具有调控作用的长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）,研究其在牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期的表达量变化,为牛肌肉发育相关机制方面的研究提供参考依据。【方法】 选取实验室前期高通量测序获得的1条lncRNA （lnc721）,通过NCBI数据库和CPC网站分析其生物学信息并预测其编码能力,通过核质分离试验确定其亚细胞定位。设计并合成lnc721的siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞,通过成熟的体外成肌细胞诱导分化模型培养牛骨骼肌卫星细胞并进行诱导分化。分别采用EdU试验、实时荧光定量PCR和Western blotting分析lnc721在细胞发育不同时期表达量的变化情况。【结果】 lnc721位于牛全基因组的18号染色体上,其蛋白编码能力为―1.33129,主要定位于细胞质内。在干扰lnc721表达量后发现,EdU阳性细胞比率极显著上升,细胞增殖标志因子Pax7和Ki-67基因的mRNA表达水平极显著上调（P<0.01）;Western blotting结果进一步证明,干扰lnc721后极显著促进了Pax7蛋白的表达（P<0.01）,在细胞分化期干扰lnc721表达后,细胞分化标志因子MyHC基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著下调（P<0.01）。【结论】 干扰lnc721表达可促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖并抑制成肌分化进程。 相似文献
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为探究二甲双胍对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响，本研究将体外培养的牛骨骼肌卫星细胞分别用0（对照组）、1、2、4 mmol/L二甲双胍进行处理，采用CCK-8法筛选出二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度，接着通过EdU染色法检测二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后对其增殖的影响，然后对二甲双胍处理的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化，通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的细胞状态，然后利用Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞的分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）、肌细胞生成素（MyoG）在分化24、48和72 h的表达情况。结果表明，二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度为2 mmol/L。2 mmol/L二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后，其细胞增殖率显著降低（P<0.05），说明二甲双胍可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖；牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现减少趋势，牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC、MyoG在分化24、48和72 h的表达均显著低于0 mmol/L （对照）组（P<0.05），说明2 mmol/L二甲双胍能够抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。研究结果表明，二甲双胍可以显著抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。该研究为二甲双胍在肌肉发育调控及肌损伤修复方面的应用提供一定的理论依据。 相似文献
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试验旨在探究油酸对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响。试验设1个空白对照组（CON）和3个油酸（OA）诱导组：50、100、200 μmol/L油酸组（OAL、OAM、OAH）。油酸诱导96 h后,通过测定细胞大小及活力评估油酸对细胞的影响。通过油红O染色和测定甘油三酯来验证脂滴的形成,通过实时荧光定量PCR测定相关成肌成脂基因的表达水平来验证脂肪细胞的生成。结果显示,与对照组相比,添加油酸后,延边牛骨骼肌卫星细胞内有脂滴生成,并且脂滴形成量、甘油三酯累积量与油酸呈剂量依赖关系;实时荧光定量PCR测定结果表明,成肌相关因子Pax3、MyoD显著下调（P<0.05）,成脂相关因子C/EBPβ、PPARγ显著上调（P<0.05）,脂肪酸代谢相关因子SCD显著下调（P<0.05）,PLIN2基因显著上调（P<0.05）。综合上述试验结果,用油酸诱导处理延边牛骨骼肌卫星细胞可促进细胞的成脂转分化。 相似文献
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为了探究lncRNA TCONS_00791383对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织（心、脾、肺、肾、背肌和腿肌）以及猪骨骼肌卫星细胞增殖分化前后TCONS_00791383的表达水平；通过设计反义核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）片段在猪骨骼肌卫星细胞中对TCONS_00791383进行敲低，检测敲低TCONS_00791383之后增殖分化标志基因的表达量变化；通过trans （co-expression）对TCONS_00791383进行靶基因预测，使用DAVID对其进行GO富集和KEGG通路分析。结果显示，TCONS_00791383在猪心脏中表达量最高，在脾和肾组织中不表达。在骨骼肌卫星细胞从增殖到分化的过程中，TCONS_00791383的表达量逐渐上升，且在分化后30 h表达量达到最高。在使用ASO片段敲低TCONS_00791383之后，与对照组相比，在分化24 h，增殖标志基因Pax3、Pax7表达量显著或极显著降低（P<0.05，P<0.01），分化标志基因MyoG表达量极显著降低（P<0.01），在分化48 h，增殖标志基因Pax3表达量极显著降低（P<0.01），Pax7表达量显著降低（P<0.05），分化标志基因MyHC表达量显著降低（P<0.05）。预测得到的相关靶基因富集到AMPK、ATP等多个与骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程相关的重要信号通路。本研究表明，lncRNA TCONS_00791383可能促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。 相似文献
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旨在对西门塔尔牛胰腺间充质干细胞（pancreatic mesenchymal stem cells,PMSCs）进行原代培养并研究其体外分化潜能,为细胞疗法和组织工程学方面提供新的种子细胞。本研究从3月龄的西门塔尔牛胚胎中无菌分离胰腺组织,分别采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离PMSCs,进行原代培养;绘制第3代、第9代、第15代细胞生长曲线并测定群体倍增时间及克隆形成能力,采用免疫荧光检测干细胞表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD34和CD45）,RT-PCR检测干细胞细胞表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166、CD34和CD45）;染色体核型分析检测其基因稳定性,通过向成脂、成骨、成软骨和成肝样细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,两种方法都可成功分离出PMSCs,细胞贴壁后形态均为长梭形,漩涡状生长,生长趋势呈典型的S形;第9代细胞群体倍增时间显著低于第15代而高于第3代（P<0.01）;第9代PMSCs克隆形成率显著低于第3代而显著高于第15代（P<0.05）;免疫荧光结果表明,PMSCs特异性表达CD29、CD44、CD73和CD90,RT-PCR结果显示PMSCs特异性表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD106和CD166,未表达造血细胞表面标志物CD34和CD45,与国际细胞治疗学会组织干细胞委员会指定的MSCs表面标记物相对应;核型分析表明,PMSCs为正常二倍体（2n=60,XY）,染色体基因组未发生变异;特异性染色和RT-PCR结果表明,从西门塔尔牛体内获得的PMSCs可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和肝样细胞。本试验证实两种方法均可成功建立西门塔尔牛PMSCs体外分离培养体系,PMSCs具有活性好、增殖速度快的特点,与MSCs有相似的生物学特性和多项分化的潜能。可为组织工程学提供新的种子细胞。 相似文献
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旨在建立西门塔尔牛表皮干细胞(epidermal stem cell, EpSCs)分离培养体系,探究其生物学特性,为西门塔尔牛种质资源保存提供新方法,为干细胞治疗研究提供种子细胞。采用3～4月龄西门塔尔牛背部表皮,通过酶消化法和组织贴壁法两种方法分离培养西门塔尔牛EpSCs,绘制EpSCs生长曲线探讨其增殖能力。通过免疫荧光鉴定EpSCs表面标记物(ITG β1、P63和CD71),通过RT-PCR分析EpSCs特异性基因(ITG β1、KRT19和ITG α6)表达情况。通过体外诱导EpSCs分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞检测其分化潜能。结果显示,组织块贴壁法获得的EpSCs纯度较低,酶消法获得的EpSCs纯度较高,细胞传代至P28代时开始逐渐老化。EpSCs细胞生长曲线呈“S”型。免疫荧光结果显示EpSCs表面特异性标记物ITG β1、P63和CD71呈阳性表达,RT-PCR结果显示EpSCs高度表达ITG β1、KRT19和ITG α6,不表达CD31基因。EpSCs诱导分化脂肪细胞时,产生可被油红O着色的脂滴,经鉴定细胞阳性表达脂肪细胞PPAR-γ和LPL特异性基因。Ep... 相似文献
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为了研究核不均一核糖核蛋白AB （heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB,HNRNPAB）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响。本研究以体外分离培养的鲁西黄牛胎牛原代骨骼肌卫星细胞为试验材料,体外诱导成肌分化,分别收取分化前和分化后第1、2、3天的细胞,提取RNA （每组设置4个重复）或蛋白质（每组设置3个重复）,通过qRT-PCR、Western blot检测HNRNPAB在成肌分化前后的表达情况。随后合成HNRNPAB的干扰RNA,并转染牛骨骼肌卫星细胞干扰HNRNPAB的表达,设置阴性对照组;在试验组和对照组中,分别利用EdU试验检测细胞增殖情况,qRT-PCR技术、Western blot技术检测HNRNPAB、增殖标志因子Pax7、Cyclin D1及分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平及蛋白表达水平。结果显示,HNRNPAB在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中的mRNA表达呈现先升后降的趋势,在分化第1天表达量最高,分化前后蛋白表达水平也具有显著差异。干扰HNRNPAB后,EdU细胞阳性率极显著上升（P<0.01）,增殖标志因子Pax7、Cyclin D1的mRNA水平与对照组相比极显著下降（P<0.01）,Pax7蛋白表达水平极显著上升（P<0.01）;与对照组相比,分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平极显著升高（P<0.01）,蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。本研究结果表明,干扰HNRNPAB后降低了牛骨骼肌卫星细胞增殖标志因子的转录水平,提高了Pax7的蛋白表达水平,并促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。 相似文献
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体外胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型。试验旨在探讨视黄酸（retinoic acid,RA）诱导鸡胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells,cESCs）向雄性生殖细胞（male germ cells,MGCs）分化的作用效果。利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维（chicken embryo fibroblast,CEF）细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色和胚胎阶段特异性表面抗原（embryo specific surface antigen 1,SSEA-1）检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定。结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性。采用10-5 mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达。结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrin α6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆。本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性。10-5 mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考。 相似文献
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旨在研究RNF20及其介导的组蛋白H2B第120位赖氨酸的单泛素化（H2Bub）对小鼠棕色脂肪细胞成脂分化的影响。采集1日龄和2月龄雄性C57BL/6小鼠的棕色脂肪组织（n=3），用Western blot方法检测RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。利用胶原酶消化法分离获得1日龄小鼠的棕色前体脂肪细胞。分别诱导棕色前体脂肪细胞和C3H10T1/2细胞系成脂分化，通过油红O染色检测其分化效果，进一步通过Western blot检测细胞分化前后（0和8 d）RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。通过siRNA干扰Rnf20基因在C3H10T1/2细胞系中的表达，油红O染色方法观察Rnf20基因对成脂分化的影响，利用qPCR和Western blot技术检测Rnf20基因的干扰效率及其介导的H2Bub水平。结果显示，2月龄小鼠棕色脂肪组织中RNF20表达量及其介导的H2Bub水平均显著高于1日龄小鼠。脂肪细胞分化标记蛋白PPARγ和CEBPα的表达水平，RNF20表达量及其介导的H2Bub水平在棕色前体脂肪细胞及C3H10T1/2细胞成脂分化后均显著增加。此外，在C3H10T1/2细胞中敲降Rnf20基因后，与阴性对照组相比，RNF20及其介导的H2Bub水平显著降低，成脂分化后脂滴明显减少。综上表明，RNF20对小鼠棕色脂肪细胞的分化是必需的，敲降Rnf20基因导致组蛋白H2Bub水平显著降低，且降低了C3H10T1/2细胞的成脂分化效率。本研究丰富了小鼠棕色脂肪细胞分化过程中的表观遗传调控研究，为深入理解动物脂肪细胞分化提供了新的基因素材。 相似文献
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旨在鉴定非编码RNA circNMT1,明确其组织和细胞的表达模式,以及探究过表达circNMT1对脂肪细胞分化的影响。本试验以30月龄中国沼泽水牛(信阳水牛,n=3)的心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、背部皮下脂肪组织和前体脂肪细胞以及3T3-L1细胞为试验材料。通过半定量PCR和实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术对circNMT1进行鉴定、细胞定位并明确其时空表达模式。进一步分别将其过表达到3T3-L1和水牛前体脂肪细胞中,利用形态学方法及定量方法检测过表达后脂滴累积情况,同时采用qRT-PCR检测脂肪标志基因相对表达水平的变化。结果表明,circNMT1是真实存在且稳定表达的circRNA,在水牛前体脂肪细胞的细胞核和细胞质中均表达,且在脂肪组织和成熟的脂肪细胞中高表达(P<0.001)。功能获得性试验表明,在3T3-L1细胞和水牛脂肪细胞,circNMT1显著促进脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高成脂标志基因PPARG、C/EBPα和FABP4的相对表达水平(P<0.01)。circNMT1可能是水牛脂肪细胞分化的正调控因子,这为circNMT1在水牛脂肪细胞中的调节作用提供了新见解。 相似文献