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水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄主水稻的感(抗)病性。为了准确在Xoc中进行T3SS基因表达调控的分析,本研究设计出桥梁载体策略,将目标基因的启动子或者功能片段构建在高拷贝的桥梁载体,获得融合表达元件,通过亚克隆的方式将融合元件转入骨架载体上,获得用于转录表达和蛋白表达分析的载体。为了验证该策略的可行性,选取hrpG、hrpX和hrcC基因构建了相应的启动子探针载体和蛋白表达载体,将这些载体导入毒性调控子基因trh、lrpX和zur的突变体中,GUS活性测定、荧光定量PCR以及蛋白免疫杂交结果显示:在trh、lrpX和zur的突变体中,hrpG、hrpX和hrcC的转录表达水平、mRNA水平和蛋白表达水平呈现一致。这表明这套桥梁载体策略能够有效应用于T3SS基因转录表达和蛋白表达的分析。综上所述,运用桥梁载体能够克服低拷贝载体DNA遗传操作效率低的缺陷,这一策略也适用于毒性相关基因调控机理的研究,这将为Xoc-水稻互作研究提供高效的工作系统。 相似文献
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水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄主水稻的感(抗)病性。为了准确在Xoc中进行T3SS基因表达调控的分析,本研究设计出桥梁载体策略,将目标基因的启动子或者功能片段构建在高拷贝的桥梁载体,获得融合表达元件,通过亚克隆的方式将融合元件转入骨架载体上,获得用于转录表达和蛋白表达分析的载体。为了验证该策略的可行性,选取hrpG、hrpX和hrcC基因构建了相应的启动子探针载体和蛋白表达载体,将这些载体导入毒性调控子基因trh、lrpX和zur的突变体中,GUS活性测定、荧光定量PCR以及蛋白免疫杂交结果显示:在trh、lrpX和zur的突变体中,hrpG、hrpX和hrcC的转录表达水平、mRNA水平和蛋白表达水平呈现一致。这表明这套桥梁载体策略能够有效应用于T3SS基因转录表达和蛋白表达的分析。综上所述,运用桥梁载体能够克服低拷贝载体DNA遗传操作效率低的缺陷,这一策略也适用于毒性相关基因调控机理的研究,这将为Xoc-水稻互作研究提供高效的工作系统。 相似文献
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水稻和稻瘟病菌互作中的信号传导及防御反应基因诱导表达的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
水稻和稻瘟病菌互作是研究植物与病原菌互作的模式体系。本文利用3个水稻抗稻瘟病近等基因品系(CO39、C101LAC和C101A51)和2个特异性菌株(M209和M210)构成不同亲和程度的互作关系,研究了稻瘟病菌对3个水稻信号传导途径关键酶合成基因、5个防御反应病程相关蛋白基因和1个防御反应转录因子调控基因诱导表达的作用。结果表明:稻瘟病菌诱导了各种互作关系中水稻OsLOX、OsAOS和OsPAL酶合成基因的表达,水稻启动了茉莉酸和水杨酸防御反应信号传导途径。在不亲和的互作反应中,稻瘟病菌能不同程度地诱导水稻OsPR1a、OsPR2、OsPR3-1、OsPR3-2和OsPR4基因的表达,从而有效激活了防御反应系统,使水稻植株表现为抗病;而在亲和的互作反应中,多数OsPR基因的表达水平低、时间短或没有表达,水稻植株表现为感病。OsMyb基因在各种互作关系中有不同的诱导表达。说明这些防御相关基因的诱导表达可能与水稻抗稻瘟病性相关。 相似文献
4.
青霉菌灭活菌丝体(Dry Mycelium of Penicillium chrysogenum,DMP)是工业生产青霉素的残余副产物,研究发现DMP能够提高多种作物的抗病性。本文研究了DMP对烟草BY-2悬浮细胞防卫反应的诱导作用,并初步探索其诱导机制,结果表明:DMP处理烟草BY-2悬浮细胞后,产生了活性氧迸发,在处理后30 min达到峰值;DMP诱导烟草BY-2悬浮细胞胞外基质碱性化,该变化能被蛋白激酶抑制剂K252a部分抑制;苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)的活性被诱导而明显升高,分别在处理后4 h和8 h达到峰值;DMP诱导了病程相关蛋白基因PR-1a、PR-1b以及抗病信号传导途径关键基因NPR1的表达。说明DMP能够诱导烟草BY-2悬浮细胞产生抗病防卫反应,其抗病信号可能是通过水杨酸信号途径进行传导的,蛋白质磷酸化参与了该抗病信号的传导过程。 相似文献
5.
为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200 bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H2O2产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。 相似文献
6.
激活蛋白PeaT1在烟草细胞膜上的结合位点及其特性 总被引：1，自引：0，他引：1
激活蛋白PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离的,能诱导植物产生系统获得抗性的蛋白激发子。为了阐明PeaT1诱导植物提高抗性的分子机制,本文采用RT-PCR技术研究了PeaT1诱导烟草悬浮细胞后不同时间PR-1a基因的转录活性,在烟草悬浮细胞中加入20μg/mL的PeaT18h后,PR-1a基因转录活性达到最高;相同浓度的PeaT1处理烟草植株,烟草叶片中酸性PR蛋白表达量升高。激光共聚焦显微镜观察到FITC荧光素标记的PeaT1可与烟草悬浮细胞表面结合;免疫荧光法进一步证明PeaT1可与烟草细胞质膜结合;使用共价交联剂BS3证明125I-PeaT1可与烟草细胞质膜上的2个分子结合,而与加热或蛋白酶处理的质膜不能发生交联,说明与PeaT1结合的分子具有蛋白特性,分子量分别为20kDa和30kDa。上述实验结果证明在烟草细胞质膜上存在着激发子PeaT1受体样的结合位点。 相似文献
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从毛头鬼伞Coprinus comatus中提取的碱性糖蛋白Y3可以降低烟草花叶病毒（TMV）的侵染。克隆获得Y3蛋白cDNA后与真核表达载体pPIC-9k连接,重组载体pPIC-9k-Y3成功电转化入毕赤酵母Pichia pastoris后,转化子在28℃、250 r/min培养条件下,使用1.0%甲醇诱导表达6 d,成功实现了Y3蛋白的真核表达。300 μg/mL浓度的Y3蛋白对普通烟进行诱导处理后摩擦接种TMV结果表明,诱导处理后烟草体内除过氧化物酶POD外,多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL和β-1,3葡聚糖酶活性都有不同程度提高。蛋白处理24 h后植株中PPO活性达到最大,为对照组的2倍。利用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）研究抗性相关基因表达情况,Y3诱导后烟草植株碱性病程相关基因1（PR1-b）、病程相关基因非表达子1（NPR1）、PAL在转录水平上均显著上调（P<0.05）。推测真核表达产物Y3蛋白可通过提高水杨酸信号途径相关防御酶活性以及抗病基因转录来诱导烟草对TMV产生系统抗性,为Y3蛋白作为生物农药开发提供理论基础。 相似文献
8.
采用从福建省稻田分离纯化的纹枯病菌(Rhizoctonia solani)菌株FJ-15接种籼稻9311,分析了水稻在纹枯病菌侵染致病过程中,编码病程相关蛋白的基因表达动态,并观察了症状的变化。Northern blot分析表明:PR1在接种12 h后开始表达,在之后的4个时间段其表达量逐步增强;而PBZ1也在12 h开始表达,在48 h表达量激剧增强几乎与72 h表达量相当。组织和症状观察表明,接种12 h后叶鞘表面菌丝纵横分枝,接种36 h后出现零星病斑,接种48 h后表现典型的受害症状,接种72 h后病斑继续扩大,并可蔓延到非接种叶鞘。结果表明,PR1和PBZ1的表达与水稻和纹枯病菌亲和互作的过程存在对应关系。 相似文献
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水稻转录因子OsBTF3对不同病原菌和信号分子的基因表达反应 总被引：5，自引：0，他引：5
转录因子基因OsBTF3在水稻品种日本晴悬浮细胞中受白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)诱导表达。为了阐明OsBTF3在水稻叶组织中的表达特征,本研究利用RT-Q-PCR技术,对经3种亲和性病原菌[水稻白叶枯病菌(Xoo)、水稻条斑病菌(Xooc)和稻瘟病菌(Mg)]接种和4种信号分子[脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)]诱导处理的水稻叶片中OsBTF3的转录本进行了定量分析。结果表明,OsBTF3对Xoo、Xooc和Mg侵染的基因表达反应均显著地受到诱导,但反应速度和强度略有差异。而4种信号分子对OsBTF3表达的诱导作用差异较大,ABA诱导活性最强,MeJA和ETH次之,SA诱导作用不显著。因此,OsBTF3基因表达不仅具有病原菌Xoo、Xooc和Mg的诱导性,而且也具有信号分子MeJA、ETH和ABA的应答性。 相似文献
10.
为检测几丁质酶的表达,制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体,探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET\|32a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0.5 mmol/L IPTG诱导4～6 h后,用Ni2+\|NTA亲和柱纯化蛋白,得到可溶的几丁质酶\|His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204 800,特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中,不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证,结果表明,稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。 几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关,目前正在进一步研究。 相似文献
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Patrick Schweizer Edith Schlagenhauf Ulrich Schaffrath Robert Dudler 《European journal of plant pathology / European Foundation for Plant Pathology》1999,105(7):659-665
Rice seedlings treated with the synthetic compound benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH) acquired resistance to subsequent attack by the rice blast fungus Magnaporthe grisea (Hebert) Barr. BTH (trade name Bion) has been released to the market as a plant protecting agent for rice. Here, we analysed the pattern of expressed genes in rice plants treated with BTH, and compared this pattern with those induced by the formerly discovered resistance inducer 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) and by Pseudomonas syringae pv. syringae, a non-host pathogen inducing a hypersensitive response. Both INA and BTH induced similar patterns of genes, suggesting that these compounds are functional analogues. In contrast, the patterns induced by the chemical inducers and by P. syringae were clearly dissimilar. 相似文献
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The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody. 相似文献
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ABSTRACT The virulence of Pseudomonas syringae subsp. savastanoi, which causes hyperplastic symptoms (knots) on olive plants, is associated with secreted phytohormones. We identified a Tn5-induced mutant of P. syringae subsp. savastanoi that did not cause disease symptoms on olive plants although it was still able to produce phytohormones. In addition, the mutant failed to elicit a hypersensitive response in a nonhost plant. Molecular characterization of the mutant revealed that a single Tn5 insertion occurred within an open reading frame encoding a protein 92% identical to the HrcC protein of P. syringae pv. syringae. Moreover, sequence analysis revealed that the gene encoding the HrcC protein in P. syringae subsp. savastanoi was part of an operon that included five genes arranged as in other phytopathogenic bacteria. These results imply that hrp/hrc genes are functional in P. syringae subsp. savastanoi and that they play a key role in the pathogenicity of this plant pathogen. 相似文献
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植物抗病激活蛋白harpinXooc防治水稻病害的研究 总被引：2，自引：1，他引：2
植物抗病激活蛋白harpinXooc由水稻条斑病细菌hrp基因簇中hpa1基因编码。用构建于表达载体pET21a（＋）上的hpa1诱导表达产物harpinXooc处理烟草，可激发烟草产生过敏反应，以及激活与烟草抗病信号途径相关的基因PR-1a、hin1和hsr203J的表达；处理水稻后，NPR1、OsPR1a、OsPR1b和PAL被激活。表明harpinXooc蛋白与植物互作后，通过水杨酸信号传导途径激活病程相关蛋白等防卫反应基因的转录表达，从而使植物产生系统获得抗病性。harpinXooc经加工后制成含量达1％的可溶性微颗粒制剂在水稻上进行应用，试验结果显示，harpinXooc蛋白可诱导水稻产生抗病性，防治水稻稻瘟病效果与杀菌剂稻瘟必克（三环唑）相当，防治水稻纹枯病和稻曲病效果与井冈霉素效果相当。对水稻增产的效果主要表现在增加粒实重上，增产达6％以上。 相似文献
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一种新的90 kD胞外蛋白激发子诱导烟草系统获得抗性研究 总被引：11，自引：4，他引：7
就棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae Saw.)培养滤液中提纯获得的90 kD胞外蛋白激发子诱发烟草系统获得抗性进行了研究。以10 nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片24 h后,在处理叶片及其上、下各2片叶片接种TMV,结果是处理叶及其上、下各2片叶片上的枯斑数显著少于对照,诱抗防效达40.9%~53.1%;接种TMV7d后处理叶片的枯斑平均直径为1.23mm,显著小于对照叶片上的枯斑直径2.97mm,但是处理叶片的上、下叶片上的枯斑平均直径与对照没有显著差别。以10 nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片分别立即接种或于1、2、4、7、15 d接种TMV,结果证明该激发子诱导烟草对TMV的抗性以处理后第1d至第4 d接种为较好,防效达30.2%~5 0.4%;处理后立即接种和第7d接种TMV诱抗防效仅4%左右,处理叶片上的枯斑数与对照没有显著差别,表明较强的诱导抗性可持续时间<7d。用不同浓度激发子处理烟叶,所测定的0.5~100 nmol/L各浓度均可显著地诱发烟草对TMV产生获得抗性,诱导抗性效果为34.9%~5 8.2%,诱导抗性效果随浓度的降低呈下降趋势。以10 nmol/L激发子溶液注射处理W38烟草叶片,2 d后分别注射接种烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)菌液或喷雾接种烟草赤星病菌(Alternaria alternata)分生孢子,结果是,注射接种烟草野火病菌5d后处理叶片及其上、下叶片上的野火病病斑均显著小于对照;处理叶片上的赤星病病斑数及病斑面积明显小于对照,表明该激发子可诱导烟草对野火病和赤星病产生抗性。上述结果表明,90kD蛋白激发子诱导烟草产生的获得抗性是一种典型的系统获得抗性,该系统获得抗性对病原菌具广谱抗性。 相似文献
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李属坏死环斑病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备 总被引：2，自引：0，他引：2
本实验用RT—PCR的方法获得李属坏死环斑病毒的印基因，并将其连接到表达载体pET-22b（＋）上，得到重组质粒pET—PNRSVCP，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG进行诱导表达。SDSPAGE和Westernblot分析结果表明，印基因在大肠杆菌中获得了高效表达，获得的融合蛋白分子量约为29．0kDa。将该融合蛋白免疫兔子，获得PNRSV特异性抗血清。酶联法（ELISA）测定的效价为1／1024。为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。 相似文献
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ABSTRACT The length and volume of cells of the plant-pathogenic bacterium Pseudomonas syringae strain B728a were measured in vitro and with time after inoculation on bean leaf surfaces to assess both the effect of nutrient availability on the cell size of P. syringae and, by inference, the variability in nutrient availability in the leaf surface habitat. Cells of P. syringae harboring a green fluorescent protein marker gene were visualized by epifluorescence microscopy after recovery from leaves or culture and their size was estimated by analysis of captured digital images. The average cell length of bacteria grown on leaves was significantly smaller than that of cultured cells, and approached that of cells starved in phosphate buffer for 24 h. The average length of cells originally grown on King's medium B decreased from approximately 2.5 to approximately 1.2 mum by 7 days after inoculation on plants. Some decrease in cell size occurred during growth of cells on leaves and continued for up to 13 days after cell multiplication ceased. Although cultured cells exhibited a normal size distribution, the size of cells recovered from bean plants at various times after inoculation was strongly right-hand skewed and was described by a log-normal distribution. The skewness of the size distribution tended to increase with time after inoculation. The reduced cell size of P. syringae B728a on plants was readily reversible when recovered cells were grown in culture. Direct in situ measurements of cell sizes on leaves confirmed that most cells of P. syringae respond to the leaf environment by reducing their size. The spatial heterogeneity of cell sizes observed on leaves suggest that nutrient availability is quite variable on the leaf surface environment. 相似文献
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NPR1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1)基因在拟南芥系统获得抗性中起着关键作用,可调控拟南芥植株广谱抗性的发生。本文报道了从心叶烟中克隆NPR1同源基因(NgNPR1)及其表达特性的研究结果。NgNPR1 cDNA全长2253 bp,编码588个氨基酸。将NgNPR1基因组全长与cDNA序列进行比对发现,NgNPR1基因组DNA含有4个外显子和3个内含子。Southern杂交分析表明,在心叶烟基因组中NgNPR1为单拷贝基因。采用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的试验,证明了NgNPR1蛋白在水杨酸诱导时会从细胞质转运到细胞核中。Northern杂交分析发现,NgNPR1基因可以被与植物抗病相关的信号分子如水杨酸、茉莉酸甲酯、过氧化氢和乙烯所诱导。进一步研究发现,植物病原物如赤星病菌、青枯病菌和烟草花叶病毒对心叶烟植株的侵染也会使NgNPR1表达量增加。这些结果表明,NgNPR1基因在心叶烟植株抵御病原物侵染过程中可能起着重要作用。 相似文献
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采用RT-PCR方法克隆了编码禾谷镰刀菌单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶Tri101基因的cDNA序列,并连接到原核表达载体pGEX-4T2上,将获得的重组载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,经IPTG诱导后,Tri101基因在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,融合蛋白GST-Tri101分子量为75.45 kDa。将该融合蛋白切胶纯化后免疫家兔,制备兔抗GST-Tri101多克隆抗体。经ELISA法测定抗体效价大于1∶256 000。Western blot分析表明制备的抗体与原核细胞体外表达的Tri101蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证了感赤霉病小麦中Tri101基因的表达。兔抗GST-Tri101抗体的成功制备,为进一步研究Tri101的生物学功能、细胞定位以及在其它植物中的表达等奠定了基础。 相似文献