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1.
《甘肃畜牧兽医》2021,51(9)
目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。 相似文献
2.
为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础. 相似文献
3.
为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。 相似文献
4.
为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础. 相似文献
5.
《中国兽医学报》2016,(12):2126-2129
通过构建比格犬ERβ稳定细胞系及其配体结合区(LBD)的真核表达载体,为探讨ERβ的功能奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ为模板,扩增出全长ERβ以及ERβ-LBD基因片段,经胶回收纯化后连接到pMD18-T载体,经测序鉴定后再连接至Lenti-OE-Flag以及pFLAG-CMV4载体。使用HEK-293T包装细胞系,包装Lenti-OEFlag-ERβ产生慢病毒,并将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系。同时将pFLAG-CMV4-ERβ-LBD质粒瞬时转染293T细胞,采用Western blot方法验证ERβ以及ERβ-LBD蛋白的表达情况。结果表明,试验成功获得ERβ稳定表达细胞系和重组质粒pFLAG-CMV4-ERβ-LBD;Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ蛋白,ERβ-LBD也可以瞬时成功表达。 相似文献
6.
猪Mx1基因的克隆表达及抗病毒活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本文应用(RT-PCR)技术,从猪瘟弱毒疫苗和Poly:IC共刺激7 h的PK15细胞的cDNA中扩增出编码Mx1蛋白的全长基因,并通过引物设计填补了PK(15)细胞系Mx1 cDNA序列中3’端11bp的缺失,成功获得Mx1完整基因的克隆。构建了重组表达质粒pRetroQ-sMx1,转染HEK293T细胞并表达Mx1蛋白,利用微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性。双酶切鉴定和核酸序列测定证实pRetroQ-sMx1真核表达质粒构建成功,转染HEK 293T细胞后,能够检测到绿色荧光,Western blot证实为目的蛋白。微量细胞病变抑制法测定重组蛋白具有一定的抗水疱性口炎病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。重组Mx1具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组Mx1蛋白的活性以及Mx1抗病毒药物奠定了基础。 相似文献
7.
为了构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP,并筛选出Lipofectamine 2000介导的高效转染细胞,本试验将柔嫩艾美尔球虫假定蛋白(Et HP)基因扩增后插入真核荧光表达载体pEGFP-N1,构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP;测序成功后,用Lipofectamine 2000介导pEGFP-N1-Et HP转染4种细胞即Vero、DF-1、BHK、HD-11;用Western blot检测确定Et HP蛋白在4种细胞内的表达,并观察转染48 h后荧光表达情况,计算5个视野内带有绿色荧光的细胞数占细胞总数的比例,从而比较质粒与Lipofectamine 2000比例不同时4种细胞的转染效率[转染效率/%=(带有绿色荧光的细胞数/细胞总数)×100%]。测序结果显示,pEGFP-N1-Et HP构建成功。Western blot检测显示,Et HP蛋白在4种细胞中均成功表达;荧光显微镜观察到4种细胞转染后48 h均出现绿色荧光,表明重组质粒pEGFP-N1-Et HP成功表达。通过转染效率的比较,发现DF-1细胞转染效率均显著高于其他细胞(P<0.0... 相似文献
8.
基于海口市动物基因工程重点实验室获得的牛乳状瘤病毒13型(BPV-13)基因组序列信息(GenBank登录号:KM258443.2),以基因组为模板,扩增E5基因片段,将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-E5-N1,测序正确后瞬时转染HEK293细胞,应用荧光显微镜、流式细胞仪、Western blotting 鉴定融合蛋白的表达。结果显示,E5片段大小为135 bp;重组质粒pEGFP-E5-N1构建正确;荧光显微镜下观察转染重组质粒pEGFP-E5-N1的HEK293细胞,可见明亮的绿色荧光;流式细胞术分析结果显示,转染重组质粒pEGFP-E5-N1 48 h后,约55.59% 的细胞表达绿色荧光蛋白;Western blotting结果表明,表达的融合蛋白大小约为32 ku。本试验结果为下一步研究E5基因的作用机理奠定了基础。 相似文献
9.
水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Western blotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。 相似文献
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11.
为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。 相似文献
12.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(5)
为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。 相似文献
13.
【目的】 对羊口疮病毒（Orf virus,ORFV） ORFV114蛋白进行生物信息学分析、转录动力学、真核表达及亚细胞定位研究。【方法】 使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV114基因进行序列比对分析;分别使用在线网站ExPASy、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA、SWISS-MODEL对ORFV114蛋白进行理化性质分析,以及跨膜区、信号肽、结构预测;在阿糖胞苷（cytarabine,Arac）存在或不存在的情况下,于ORFV感染HeLa细胞后多个时间点收获细胞,RT-PCR扩增ORFV114基因,确定ORFV114蛋白的动态转录水平;PCR扩增ORFV114基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV114重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,经脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染HEK293细胞,通过Western blotting鉴定ORFV114-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV114重组质粒瞬时转染HeLa细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV114蛋白的亚细胞定位。【结果】 ORFV-JS株ORFV114基因大小为1 041 bp,在ORFV毒株中高度保守;ORFV114蛋白包含346个氨基酸,预测分子质量大小为38 ku;ORFV114为弱亲水性不稳定蛋白,无跨膜区域,无信号肽;其二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,分别占45.09%、25.14%、21.68%和8.09%;在Arac存在或不存在的情况下,ORFV114的转录在ORFV感染后2 h即可被检测到,且随感染时间的延长转录水平不断提高,即Arac并未抑制ORFV114转录,ORFV114为ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV114重组质粒,ORFV114-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,融合蛋白大小约65 ku;ORFV114蛋白主要定位在HeLa细胞的细胞质中且呈点状分布。【结论】 本研究成功地对ORFV114蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位,为进一步探索ORFV114蛋白功能及筛选互作蛋白奠定基础。 相似文献
14.
本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白（NS1）真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白。首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒（A/Anhui/3/2013(H7N9)）的总RNA,通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全长基因,然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中,通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达。结果表明成功克隆了NS1全长基因,构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T细胞中转染表达,Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达。该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白,为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。 相似文献
15.
《中国预防兽医学报》2018,(12)
为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白(P)的生化功能,本研究通过PCR将PPRV p全长基因扩增后克隆至真核表达载体pcDNA4/TO中,构建了重组质粒pcDNA4/TO-PPRVP。将该质粒转染至已稳定转入pcDNA6/TR质粒的T-REx293细胞中,并用博来霉素和稻瘟菌素筛选存活克隆。将强力霉素添加至存活细胞克隆中诱导P蛋白表达,Western blot及间接免疫荧光试验鉴定出可诱导表达P蛋白的细胞克隆,扩增阳性克隆获得能够稳定表达P蛋白的细胞系。Western blot显示该细胞系表达的P蛋白能够与山羊PPRV阳性血清反应,并能够有效抑制聚肌胞苷酸诱导的STAT1磷酸化,表明该细胞系表达的重组PPRV P蛋白具有与野生型P蛋白类似的生物活性。本研究利用Tet on系统建立了表达PPRV P蛋白的真核细胞系,为深入研究PPRV的致病机制奠定了基础。 相似文献
16.
本研究以测序质粒为模板,扩增出结构蛋白基因ORF2a-ORF7,将此基因片段插入真核表达栽体pEGFP-N3中构建重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7),然后将重组表达质粒转染293T细胞.通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有绿色荧光出现.SDS-PAGE电泳和western blot分析结果表明重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有EGFP表达;仅ORF7有43 ku的融合蛋白EGFP出现,与预期大小相符;其他重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF6)均没有融合蛋白出现.本实验为进一步研究这些蛋白的结构和生物学功能奠定了基础. 相似文献
17.
《中国兽医学报》2016,(2):249-251
为了建立ERβ1293的稳定表达细胞系,为ERβ1293的功能研究奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ1293为模板,扩增出全长ERβ1293,经胶回收纯化后连接到pMD18-T Vector,经测序鉴定后双酶切连接至Lenti-OE-Flag载体,重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定;使用HEK-293T包装细胞系,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系,并采用Western blot方法验证基因表达情况。结果获得了Lenti-OE-Flag-ERβ1293重组质粒,并成功包装成慢病毒。利用病毒感染HEK293细胞后获得了稳定表达细胞系,Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ1293蛋白,为研究ERβ1293的功能奠定了基础。 相似文献
18.
采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。 相似文献
19.
针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明：成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。 相似文献
20.
针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明:成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。 相似文献