水牛MD-2cDNA基因的克隆与原核表达     

焦寒伟  杜丽  雷明  张冬琳  郝永昌  张晓茹  匡文华  成鹰  王凤阳 《动物医学进展》2011,32(9):9-13

为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定.采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28a-bMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21( DE3)中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Wester...  相似文献   

水牛TLR2cDNA的克隆与生物信息学分析     

张晓茹  匡文华  成鹰  杜丽  张冬琳  郝永昌  雷明  刘涛  焦寒伟  王凤阳  祁超 《动物医学进展》2011,32(11):35-41

本研究通过RT-PCR分段扩增得到水牛Toll样受体2(TLR2) cDNA序列,并利用亚克隆重叠区进行全长序列拼接.将拼接产物与pMD20-T栽体连接,重组质粒经PCR酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析.结果表明,克隆得到的序列全长2 455 bp,含有一个大小为2 355 bp的开放阅读框,共编码784个氨基酸,...  相似文献   

中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2cDNA的克隆与原核表达     

焦寒伟  王洪梅  刘晓  杜丽  雷明  张冬琳  郝永昌  成鹰  何洪彬  王凤阳 《中国畜牧兽医》2012,39(2):20-24

本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein -2,MD-2)基因,并用Western blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2 cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25 ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2 cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。  相似文献   

海南坡鹿MD2cDNA的克隆及其生物信息学分析     

杜丽  谢少林  成鹰  张晓茹  匡文华  焦寒伟  张冬琳  郝永昌  雷明  刘涛  王凤阳 《热带生物学报》2011,(1):1-5

以海南坡鹿外周血白细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,获得海南坡鹿MD2全长cDNA,并对其进行较系统的生物信息学分析,内容包括序列特征分析、同源性分析、编码蛋白质理化性质及结构预测.结果表明:海南坡鹿MD2的CDS序列长度为486 bp,编码160个氨基酸,与黄牛、人、欧洲兔、褐家鼠的核苷酸序列同源性分别为98...  相似文献   

水牛Cdc42cDNA的克隆与生物信息学分析     

张晓茹  匡文华  成鹰  杜丽  雷明  焦寒伟  张冬琳  郝永昌  祁超  王凤阳 《热带生物学报》2011,(4):349-354

通过RT-PCR扩增得到水牛细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)cDNA序列,将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的序列全长626 bp,含有1个大小为576 bp的开放阅读框,共编码191个氨基酸,相对分子质量为21.3×103,理论等电点为6.1...  相似文献   

海南坡鹿MYD88cDNA的克隆及其生物信息学分析     

满初日嘎  谢少林  杜丽  成鹰  张冬琳  王凤阳 《吉林农业大学学报》2011,33(3):319-323

以海南坡鹿外周血白细胞为材料,利用RT-PCR技术获得海南坡鹿髓样分化因子(myeloid diffrentiation factor 88,MYD88)基因完整的CDS序列,并对其进行了较系统的生物信息学分析.结果表明:该基因CDS区含有89l bp,编码296个氨基酸,该分子具有高度的进化保守性,编码蛋白无跨膜区,...  相似文献   

水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达     

张晓茹  匡文华  成鹰  杜丽  张冬琳  郝永昌  雷明  焦寒伟  刘涛  祁超  王凤阳 《广西农业生物科学》2011,30(2):190-196

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。  相似文献   

水牛TLR4 cDNA全长的克隆及其生物信息学分析     

匡文华  张晓茹  成鹰  杜丽  张冬琳  郝永昌  雷明  焦寒伟  刘涛  祁超  王凤阳 《中国畜牧兽医》2011,38(7):108-114

本研究利用RT-PCR方法分段克隆水牛TLR4 cDNA后拼接成全长,并克隆于pMD20-T载体中,同时运用生物信息学软件对其核苷酸序列及编码蛋白质的结构进行分析和预测。结果表明,克隆的TLR4 cDNA ORF全长2526 bp,共编码841个氨基酸,N端具有由25个氨基酸组成的信号肽,该蛋白预测的分子质量为95.98 ku,等电点为6.37;水牛TLR4与GenBank中登录的水牛TLR4(DQ857349)核苷酸序列同源性达99.01%,与黄牛、绵羊、野猪、马、人和黑猩猩的同源性超过80%,与小鼠和狗的同源性次之,分别为72.17%和61.30%,与鸡的最低,仅为53.94%;该蛋白是由胞外区(1-634位氨基酸)、跨膜区(635-657位氨基酸)和胞内区(658-841位氨基酸)3部分构成的跨膜蛋白,胞外区含有12个LRR串联重复结构域、胞内区具有TIR结构域。本试验成功克隆了水牛TLR4 cDNA全长,并获得了核苷酸及其蛋白质的生物信息学分析数据,为进一步研究其功能奠定了基础。  相似文献   

海南黄牛Cdc42 cDNA的克隆、表达及鉴定   总被引：2，自引：2，他引：0  

张冬琳  杜丽  成鹰  刘涛  雷明  满初日嘎  王凤阳 《中国畜牧兽医》2011,38(6):68-71

试验以构建的海南黄牛外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR的方法筛选出海南黄牛细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)全长cDNA,构建pET28a-Cdc42重组质粒,经IPTG诱导表达后,进行可溶性分析和蛋白纯化,并应用Western blotting对其进行鉴定。结果显示,海南黄牛Cdc42 cDNA的编码框由576个碱基组成,编码191个氨基酸,融合蛋白分子质量约为30 ku,该蛋白主要以包涵体形式存在;纯化后的蛋白经Western blotting检测,发现对应大小的特异性条带,表明本试验成功克隆Cdc42并表达。  相似文献   

水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达   总被引：1，自引：1，他引：0  

匡文华  张晓茹  成鹰  杜丽  雷明  焦寒伟  张冬琳  郝永昌  祁超  王凤阳 《中国畜牧兽医》2012,39(4):50-54

将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Western blotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。  相似文献