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1.
[目的] 构建表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组猪痘病毒（recombinant Swinepox virus,rSWPV）,制备抗GFP单克隆抗体。[方法] 首先合成3'-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV（SWPV-JX20G株）同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。[结果] PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体效价高达1：256 000。采用杂交瘤技术制备了9株能稳定分泌抗EGFP-His单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA和Western blotting结果显示,9株单克隆抗体中的7株针对GFP的线性表位,另外2株单克隆抗体针对GFP的构象表位。[结论] 本研究成功制备了EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His的单克隆抗体,为后续建立GFP的免疫学检测方法提供了必备材料。 相似文献
2.
为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体,采用表达纯化的PRRSV NADC30-like毒株的GP5蛋白按常规方法免疫小鼠,采用间接免疫荧光方法筛选出1株阳性杂交瘤细胞（命名为3E10）,经3次亚克隆后制备腹水并进行纯化鉴定。结果显示：该杂交瘤细胞连续传代20代后细胞上清液的IFA效价仍不低于1:40。纯化后的单克隆抗体腹水浓度为0.204 mg/mL,亚类鉴定为IgM,且未发现有中和活性。特异性检测显示3E10单克隆抗体能与2株PRRSV NADC30-like毒株发生荧光反应,而与4株高致病性PRRSV疫苗毒株、2株经典株PRRSV疫苗毒株以及CSFV、PCV2、BVDV及Marc-145细胞均无荧光反应,显示出较好的应用前景。 相似文献
3.
为获得禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白的单克隆抗体,通过原核表达AEV VP1蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得2株杂交瘤细胞株,命名为4#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的株单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG2a,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与AEV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。运用建立的IFA对单抗进行了初步运用,在外源病毒检测方面与经典方法符合率高。本研究成功制备了AEV单克隆抗体,为进一步建立AEV检测方法和深入研究AEV的生物学特性奠定了基础。 相似文献
4.
为制备抗鸭1型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）结构蛋白VP1的单克隆抗体（MAbs）,本研究以pGEX-VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,同时以纯化浓缩的全病毒作为包被抗原,建立了筛选抗VP1蛋白阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法,经融合、筛选制备杂交瘤细胞及鉴定MAbs的稳定性、特异性、腹水效价和中和活性等生物学活性,获得了2株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞（1A2和5G3）。MAbs腹水ELISA效价分别为1：3.2×104和1：2.0×106。亚类鉴定均为IgG1/κ型。Western blotting结果显示,2株MAbs均能与DHAV-1a VP1蛋白和DHAV-1a全病毒发生特异性反应。特异性试验结果显示2株MAbs能与鸭1型甲肝病毒（DHAV-1）和DHAV-1a发生交叉反应。中和试验结果显示5G3株具有中和活性。结果表明2株MAbs的ELISA效价高、特异性强、稳定性好,均能与DHAV-1和DHAV-1a全病毒发生特异性反应,其中一株具有中和活性。 相似文献
5.
非洲猪瘟病毒pS273R蛋白水解酶单克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在制备非洲猪瘟病毒（ASFV） S273R蛋白的特异性单克隆抗体。本研究以原核表达的非洲猪瘟病毒重组S273R蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的S273R蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了4株可稳定分泌抗ASFV S273R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过免疫印迹（Western blot）和免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）测定了其免疫特性。4株单克隆抗体亚类均为IgG1型,轻链均为κ链。本研究获得的非洲猪瘟病毒S373R蛋白单克隆抗体可为进一步研究ASFV pS273R的生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 相似文献
6.
1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为84M～K142;噬菌体淘选试验结果表明,116TSSFETLFE124为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。 相似文献
7.
抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体的制备及在抗原捕捉ELISA中的应用 总被引：2，自引：1，他引：1
本研究以原核表达、纯化的扎伊尔株埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）VP40蛋白片段免疫BALB／c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得一株分泌抗EBOVVP40蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。以重组杆状病毒表达EBOV VP40蛋白为抗原,经Western blot和间接免疫荧光检测该单克隆抗体显示出良好的特异性免疫反应。采用该株杂交瘤细胞系经腹腔注射接种8日龄BALB／c小鼠,制备腹水,并经纯化和HRP标记,获得HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体。从而,初步建立一种抗原捕捉ELSIA诊断方法,以原核表达EBOV VP40蛋白片段兔抗血清为一抗,应用HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体检测杆状病毒表达的重组EBOV VP40蛋白显示出良好的敏感性和特异性。结果表明,初步建立的抗原捕捉ELSIA诊断方法有希望成为一种理想的检测EBOV感染的诊断方法。 相似文献
8.
为获得鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)N蛋白的单克隆抗体,通过原核表达IBV N蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株,命名为1#、18#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的3株单克隆抗体亚型均为IgG1,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与IBV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。本研究成功制备了IBV单克隆抗体,为进一步建立IBV检测方法和深入研究IBV的生物学特性奠定了基础。 相似文献
9.
为制备抗A型塞内卡病毒(SVA)VP1蛋白的单克隆抗体,并初步应用于A型塞内卡病毒的检测,本研究构建了SVA VP1原核重组表达质粒pET30a-GST-VP1(528 bp)。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞并大量表达VP1重组蛋白,利用纯化的VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合,经过细胞亚克隆筛选,获得杂交瘤细胞。将其选为腹水生产细胞株,最后纯化单克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光试验对其进行鉴定。结果显示,本研究获得1株能够稳定分泌抗VP1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,其亚型重链为IgG2a、轻链为Kappa链;Western blotting和间接免疫荧光检测显示,该单克隆抗体能够特异性识别SVA病毒粒子。本研究成功制备的抗SVA VP1蛋白单克隆抗体可为进一步研究A型塞内卡病毒VP1蛋白的生物学功能及A型塞内卡病毒致病机制提供有效途径。 相似文献
10.
《中国预防兽医学报》2017,(12)
为制备抗猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白VP1的单克隆抗体(MAb)及鉴定其表位,本研究以原核表达的重组VP1-E蛋白(aa427~aa524)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞;以纯化的FCV-2280病毒粒子作为检测抗原,采用间接ELISA检测方法筛选杂交瘤细胞株,分析杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型、中和活性及所识别的抗原表位等。结果表明,获得两株稳定分泌抗FCV VP1-E MAbs的杂交瘤细胞E2F1和E2F6,抗体均为IgG1亚型,轻链为κ链。杂交瘤细胞分泌的抗体无中和活性。Western blot结果显示,两种抗体可以特异性识别FCV-2280,表明其针对的抗原表位为线性表位。两株MAb识别VP1-E序列均为~(467)YICGSLQRAWG~(477)。生物信息学分析显示该抗原表位在FCV VP1蛋白中相对保守。该MAb为建立特异性强、灵敏度高的FCV的检测方法奠定基础。 相似文献
11.
[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。 相似文献
12.
以伪狂犬病毒（PRV）作为免疫原,免疫BALB／c小鼠,融合之后经间接ELISA、IFA和IHC试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRV单克隆抗体（简称单抗）的杂交瘤细胞株。2株猪伪狂犬病毒单抗与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒均无交叉反应,IFA结果显示单抗能与接种于猪睾丸细胞（ST）的PRV发生特异性反应,IHC结果显示单抗能用感染了PRV的猪神经组织发生反应,证实抗PRV单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,此结论为猪伪狂犬病毒抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
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[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。 相似文献
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[目的] 获得抗原性好的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。[方法] 根据GenBank ASFV参考序列（登录号：NC_044959.2）合成360-12L基因,并插入pET-28a（+）载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。[结果] 成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37 ℃ 6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1：512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体具有良好的特异性,可特异性识别12L重组蛋白。[结论] 原核表达的12L重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究12L蛋白的生物学功能、ASFV血清学诊断技术和疫苗研究提供生物材料。 相似文献
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[目的] 筛选具有高抗氧化性的乳酸菌并进行菌种鉴定,为缓解畜禽养殖过程中的氧化应激提供新型抗氧化微生态制剂。[方法] 以体外耐受过氧化氢氧化胁迫方法进行初筛,以体外对过氧化氢的耐受存活率为指标进行复筛,从27株菌株中筛选具有显著抗氧化能力的乳酸菌;然后以DPPH自由基（DPPH·）和羟自由基（HO·）清除能力、还原活性、抗脂质过氧化能力、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase,T-SOD）和总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）等为指标评价乳酸菌的体外抗氧化性能。[结果] 从27株筛选菌株中最终确定了1株具有高抗氧化活性的乳酸菌C2-0327,其对DPPH·清除率为95.2%,HO·清除率达141.0%,还原活性达3 147 μmol/L（以L-半胱氨酸当量计）,抗脂质过氧化率达82.9%,T-SOD活性和T-AOC分别达81.32和20.10 U/mL。经16S rDNA分子鉴定,该菌株为戊糖片球菌C2-0327。[结论] 筛选、鉴定得到1株高抗氧化活性乳酸菌,鉴定为戊糖片球菌C2-0327,可用于新型抗氧化微生态制剂的研制。 相似文献
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目的 对高效液相色谱法测定巴氏杀菌乳中糠氨酸含量的不确定度进行评定。方法 依据《NY/T939—2016 巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》测定巴氏杀菌乳中糠氨酸的含量。通过建立数学模型,全面分析试验过程中各不确定度的来源,并对其进行量化评定,计算合成相对标准不确定度和扩展不确定度。结果 当牛奶中糠氨酸含量为7.3 mg/100 g 蛋白质时,测量结果的扩展不确定度为0.4 mg/100 g蛋白质（k=2）。结论 方法中测量不确定度的主要来源为糠氨酸标准物质称量、标准工作液的配制、标准曲线的拟合和样品水解液中蛋白质含量测定终点判定。 相似文献
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本实验室对从疑似犬细小病毒感染的发病犬分离的病毒采用同步培养法接种猫肾细胞（CRFK）增殖,通过PCR试验、IFA试验和VP2基因测序分析等方法进行鉴定并分型,获得一株犬细小病毒强毒株,命名为CPV-DD株。对分离病毒进行PCR扩增,可扩增出特异性DNA片段（1 163 bp）;盲传至第6代时,病毒液的HA效价为1∶1... 相似文献