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1.
【目的】探索梅花鹿成纤维细胞因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)基因多态性及其对茸重性状的影响。【方法】应用直接测序法对梅花鹿FGFR2基因的全部外显子进行测序分析,通过MassARRAY® SNP分型技术对314头24月龄梅花鹿进行基因分型和单倍型分析,分析FGFR2基因不同基因型和单倍型与茸重的关联性。【结果】在梅花鹿FGFR2基因中共发现12个多态性位点,其中5个位于外显子区域,且突变均未引起氨基酸改变,属于同义突变,其余7个位点均存在于内含子区域。分型结果显示,g.80975864 T>G位点未分型成功,后续对其余11个位点进行了分析,g.80943673 T>C、g.80943683 C>A及g.80938352 C>T 3个位点属于中度多态位点(0.25＜P＜0.5),其余位点均属于低度多态位点(P＜0.25)。χ2检验结果表明,g.80998742 G>A和g.80987708 G>A 2个位点偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05),其他9个位点均处于Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。关联分析结果表明,11个多态性位点各基因型之间的茸重差异均不显著(P＞0.05)。单倍型结果显示,FGFR2基因存在5种单倍型,不同单倍型间梅花鹿茸重差异均不显著(P＞0.05)。【结论】FGFR2基因的11个突变位点可能不是影响梅花鹿茸重性状的关键位点。 相似文献
2.
【目的】 本研究旨在探索梅花鹿甲硫氨酸亚砜还原酶B3（methionine sulfoxide reductase B3，MSRB3）基因多态性及其与茸重性状的关联性。【方法】 选取高、低产茸量的梅花鹿各8只，应用DNA直接测序法检测基因变异位点。采用MassARRAY® SNP分型技术对314头24月龄梅花鹿MSRB3基因进行基因分型，并结合梅花鹿茸重性状数据进行了关联分析和单倍型分析。【结果】 在梅花鹿MSRB3基因中共发现6个SNPs位点，其中2个SNPs位点位于外显子区域，且突变均未引起氨基酸改变，属于同义突变，其余4个SNPs位点均存在于内含子区域。分型结果显示4个样本未分型成功，其余310个样本进行后续分析。各位点观测杂合度和期望杂合度基本一致，g.44455582 T>C、g.44455759 C>T、g.44414424 T>C、g.44350306 T>C及g.44340836 G>A等5个位点的杂合度较高，均属于中度多态（0.25<PIC<0.5），g.44340734 G>C位点杂合度较低，属于低度多态（PIC<0.25）。卡方检验结果表明，g.44455759 C>T位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05），其他5个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。对6个SNPs位点的不同基因型与梅花鹿茸重的关联分析结果表明，g.44455582 T>C位点的TT基因型个体茸重极显著高于CC和TC基因型（P<0.01）。单倍型分析结果显示，g.44340734 G>C和g.44350306 T>C、g.44455582 T>C和g.44455759 C>T位点存在强连锁，各产生3种单倍型，在Block 2区块中单倍型TC茸重显著高于单倍型CT （P<0.05）。【结论】 MSRB3基因与梅花鹿茸重性状密切相关，g.44455582 T>C位点和单倍型TC可作为筛选高产梅花鹿的分子标记。 相似文献
3.
【目的】 肺炎克雷伯菌是人畜共患的条件致病菌, 是引起水貂肺炎的常见病原菌之一。试验主要对吉林省某水貂养殖场送检的6只患有肺炎的病死水貂进行细菌分离鉴定及耐药性分析, 为指导临床合理用药提供依据。【方法】 通过分离纯化方法从样品中分离菌株并进行PCR鉴定, 应用多位点序列分型技术(MLST)进行菌株ST分型。通过感染小鼠了解菌株的致病性, PCR检测血清型及毒力基因的携带情况; 运用琼脂稀释法检测分离菌株对18种药物的敏感性, 并通过PCR检测分离菌株耐药基因的携带情况。【结果】 分离得到的6株菌株经PCR鉴定为肺炎克雷伯菌; MLST分析结果表明6株菌株分别有6种ST型, 分别为: ST2594、ST1782、ST2844、ST2330、ST86和ST661。致病性分析结果显示, 6株菌株均可引起小鼠死亡, 共检测出6种毒力基因, 未检测到毒力较强的血清型。药敏试验结果显示, 6株肺炎克雷伯菌对头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星较敏感, 对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、氨苄西林、环丙沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、多西环素和氟苯尼考较耐药。耐药基因检测结果显示, 6株菌株共检测出blaSHV、blaTEM-1、blaCTX-M-1G、aadA1、aac(3’)-Ⅳ、aac(3’)-Ⅱc、aph(4’)-Ⅰa、aph(3’)-Ⅶ、aph(3’)-Ⅳ、aph(2’)-Ⅰb、rmtB、qnrB、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、floR和mcr-1 18种耐药基因。【结论】 分离到的6株肺炎克雷伯菌株为不同的种系进化, 并具有较强的致病性和耐药性, 为临床用药治疗带来困难。 相似文献
4.
本试验旨在研究奶牛结核分枝杆菌rpoB和katG基因突变与耐药性之间的关系。将临床分离的30株牛源结核分枝杆菌,利用噬菌体生物扩增法（phage amplified biologically assay,PhaB）检测其对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的药物敏感性,采用聚合酶链式反应—DNA直接测序法（PCR-DS）扩增rpoB和katG基因并测序,分析rpoB和katG基因突变及其耐药相关性。15株表型耐药菌株中4株单耐RFP,PCR产物直接测序后发现3株在rpoB基因531位点发生突变,突变率为75.00%（3/4）;9株单耐INH菌株中7株发生突变,6株katG基因315位点基因突变,突变率为85.71%(6/7),1株发现463位点密码子基因突变,突变率为14.29%（1/7）;2株耐RFP的同时也对INH耐药,测序发现2株均在rpoB基因的531位点〖JP2〗和katG基因的315位点发生突变。所有菌株均未发现rpoB和katG基因的缺失。rpoB基因531位点和katG基因315位点的突变是RFP和INH产生耐药性的主要机制;检测牛源结核分枝杆菌RFP耐药性的同时可以初步筛选耐多药结核分枝杆菌。 相似文献
5.
【目的】 分析鹅p21基因的结构和启动子活性，探讨p21基因的转录调控机制。【方法】 以泰州鹅为试验对象，通过同源克隆、RACE和生物信息学分析等方法获得鹅p21基因全长序列和5′-侧翼区序列特征；构建6个不同缺失片段的启动子区双荧光素酶报告载体并分析其荧光素酶活性，进而确定p21基因核心启动子区；对核心启动子区转录因子结合位点生肌决定因子(MyoD)(+25~+36 bp)进行定点突变，并构建突变报告基因载体，在C2C12细胞系内初步鉴定鹅p21基因核心转录调控因子。【结果】 鹅p21基因cDNA全长1 943 bp，CDS区大小为453 bp，编码151个氨基酸，蛋白序列包含高度保守的CDI家族结合位点。系统进化树分析表明，鹅p21基因与鸭亲缘关系最近，与鸡和火鸡有较强的进化关系。鹅p21基因5′-侧翼区包含启动子元件，—35~+37 bp是核心启动子区，发挥正向调控作用，结合定点突变技术初步鉴定MyoD是鹅p21基因核心转录调控元件。【结论】 本研究获得了鹅p21基因完整的cDNA序列和启动子区域，MyoD是p21基因核心转录调控因子，为探究p21基因在鹅胚胎期肌肉发育过程中的调控机制提供理论依据。 相似文献
6.
【目的】 通过高通量混池重测序和选择清除分析比较鸭不同产蛋量组间基因组显著差异区域内的SNP和基因差异,以筛选和鉴定出鸭产蛋量相关的遗传变异位点和功能基因,为通过分子遗传育种手段提高鸭产蛋性能提供依据。【方法】 根据金定鸭群体开产后150 d内个体产蛋量情况,选择2种极端表型,分为高产蛋组（CH）和低产蛋组（CL）。基于混池全基因组重测序和选择清除分析技术筛选不同鸭产蛋量组间基因组显著差异区域内的SNP及相关功能基因,通过单个样本PCR扩增子测序对筛选的产蛋量相关SNP进行验证,对筛选的候选基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,确定候选基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径,并分析不同基因型间产蛋量高低差异。【结果】 在低产蛋量组和高产蛋量组分别获得192 071 438和229 836 820条的clean reads,共定位到的SNP差异极显著区间为1 368个,受选择候选基因为214个,而且这些区间和基因主要位于Z号染色体,主要包括KDM4C、LURAP1L、PTCH1、PRUNE2、TRPM3和VPS13AD等基因。验证结果表明重测序结果准确。GO功能分析表明,受选择基因在分子功能、细胞组分和生物过程3个本体中均有富集。KEGG通路富集分析表明,受选择基因主要富集到代谢途径、肌动蛋白骨架调节、真核生物核糖体发生等信号通路。鉴定出候选基因KDM4C上Z-28286537、Z-28286879、Z-28288421、Z-28434122和Z-28436368位点,LURAP1L基因上Z-30802227位点、TRPM3基因上Z-36500134、Z-36503668、Z-36534782、Z-36684262、Z-36710928和Z-36732487位点,VPS13A基因上Z-37498270和Z-37513004位点,PTCH1基因上Z-41510597位点显著影响鸭的产蛋量（P<0.05）。【结论】 鸭Z号染色体上存在多个与鸭产蛋量显著相关的SNPs位点及相关基因,本研究结果为通过分子遗传育种手段提高蛋鸭产蛋性能提供了依据。 相似文献
7.
1株跨属感染猪霍乱沙门菌和大肠杆菌烈性噬菌体的分离及其生物学特性 总被引：2，自引：2，他引：0
从健康猪肠道内容物分离鉴定猪霍乱沙门菌（Salmonella choleraesuis,S.choleraesuis）的烈性噬菌体,并对其进行生物学特性分析。以S.choleraesuis 13122为宿主菌,用双层平板法从猪肠道黏膜和食糜样品中分离噬菌体,用电镜形态观察和基因组测序确定其分类,用点滴法和双层平板法测定其在大肠杆菌上的宿主谱,用浊度法测定其裂菌效力。分离到1株猪霍乱沙门菌噬菌体,命名为沙门菌噬菌体L6jm（Salmonella phage L6jm）。L6jm头部呈正多面体直径约75 nm,具有非收缩性的尾部,长约190 nm,其基因组无整合酶基因和细菌基因组,故判定为烈性噬菌体;L6jm可感染S.choleraesuis 13122并跨属感染1株大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）244,同时,可裂解9株大肠杆菌,包括1株产肠毒素大肠杆菌（ETEC）;L6jm在S.choleraesuis 13122和E.coli 244上的最佳感染复数分别为0.01和0.001;潜伏期均为15 min,暴发期分别为145和125 min;L6jm在≤50℃,pH为3~11时稳定;L6jm在液体培养基中对S.choleraesuis 13122有显著（P<0.05）的抑菌效果,对ETEC104在MOI 100时也可产生显著（P<0.05）的抑菌效果。L6jm可跨属感染S.choleraesuis和E.coli,且能裂解1株ETEC,具有防治沙门菌和大肠杆菌感染的应用潜力。 相似文献
8.
【目的】探究肌细胞增强因子2C（myocyte enhancer factor 2C,MEF2C）基因多态性对黔东南小香鸡体重和体尺性状的影响。【方法】试验以251羽300日龄黔东南小香鸡为研究对象,利用PCR扩增和直接测序技术对MEF2C基因全部（15个）外显子进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点筛选,并运用SPSS 18.0统计分析软件对不同SNPs位点所对应的基因型与黔东南小香鸡的体重、体尺性状进行相关性分析。【结果】黔东南小香鸡群体中仅在MEF2C基因外显子12上发现3个SNPs位点：g.1819 T＞C、g.2426 T＞C和g.2543 C＞T,在其他外显子中未发现多态位点。χ2检验结果表明,3个SNPs在黔东南小香鸡群体中均偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。关联分析结果显示,g.1819 T＞C位点TC基因型个体体斜长、胸深和胫围均极显著高于TT和CC基因型,体重极显著高于TT基因型（P＜0.01）;TC基因型个体胫长显著高于TT和CC基因,龙骨长显著高于TT基因型（P＜0.05）。g.2426 T＞C和g.2543 C＞T位点互为连锁平衡位点,对胫围有极显著影响（P＜0.01）。【结论】黔东南小香鸡MEF2C基因外显子具有较强的保守性,g.1819 T>C位点可以作为黔东南小香鸡分子标记辅助选育参考位点。 相似文献
9.
【目的】 分析不同环境下鸡蛋外壳携带蜡样芽孢杆菌的情况和分离菌株的基本特征。【方法】 从养殖场和超市各采集9种新鲜鸡蛋,对鸡蛋表面携带的蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定、基因分型、毒力基因筛查和耐药性分析。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对分离菌株进行初步鉴定,全基因组测序后进行菌种鉴定并确定基因分型、筛选毒力基因和耐药基因,同时采用微量肉汤稀释法测定分离株对头孢曲松、红霉素、万古霉素等12种抗菌药物的耐药性。【结果】 经MALDI-TOF MS初步鉴定和基因组菌种鉴定,确定从养殖场3种未经清洁加工的鲜蛋中分离出的6个菌株为蜡样芽孢杆菌,其序列分型（ST）较为多样,其中有2株新的ST型。在毒力基因筛查方面,6株蜡样芽孢杆菌均检出了非溶血型肠毒素nheB基因、腹泻型毒力因子hlyⅡ基因和侵袭免疫系统的inhA基因;nheA和nheC基因携带率为83.3%,编码溶血型肠毒素HBL的hblA、hblC和hblD基因携带率均为66.7%;cytK和hlyⅢ基因携带率分别为33.3%和50.0%;肠毒素基因BceT、entFM和致吐毒素基因ces均未检出。耐药性方面,6株菌均对庆大霉素、四环素、氯霉素、利福平、利奈唑胺和环丙沙星敏感,对氨苄西林、头孢曲松和泰妙菌素耐药;对红霉素、克林霉素的中介率分别为83.3%和100%;33.3%的菌株对万古霉素耐药。6株菌均携带有磷霉素耐药基因FosB和万古霉素耐药基因簇vanA的部分基因vanRSYZ,其中5株菌携带大环内酯类药物耐药基因mphL,部分菌株携带β-内酰胺类药物耐药基因或核苷类药物耐药基因。【结论】 本试验从养殖场未经消毒处理的鸡蛋外壳上成功分离到了蜡样芽孢杆菌,并发现其携带有多种毒力基因,存在多重耐药性,有潜在致病性和公共安全风险。 相似文献
10.
【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。 相似文献
11.
【目的】通过构建鸭疫里默氏杆菌RIA_0940基因缺失株并测定其生物学特性,探讨RIA_0940基因的潜在功能。【方法】以鸭疫里默氏杆菌RA-GD株为亲本株,扩增其左右同源臂及红霉素抗性基因（ermR）盒片段,构建左同源臂-ermR抗性基因盒-右同源臂融合片段,通过自然转化的方法缺失RA-GD株RIA_0940基因,并利用PCR筛选、鉴定RA-GDΔRIA_0940基因缺失株。分别对亲本株RA-GD和缺失株RA-GDΔRIA_0940的生长特性、对雏鸭的半数致死量、感染鸭血液和组织载菌量及对Vero细胞的黏附和入侵性能进行比较分析。【结果】试验成功构建了RA-GD株的RIA_0940基因缺失株（RA-GDΔRIA_0940）;生物学特性检测结果显示,RA-GDΔRIA_0940株体外生长能力较亲本株低,基因缺失株在生长后期生长受到显著或极显著抑制（P<0.05;P<0.01）;RA-GDΔRIA_0940株对雏鸭的半数致死量是亲本株的114倍;与亲本株相比,缺失株感染鸭血液和组织的载菌量显著或极显著下降（P<0.05;P<0.01）;缺失株对Vero细胞的黏附和入侵性能均极显著低于亲本株（P<0.01）。【结论】本试验成功构建RA-GD株RIA_0940基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下生长能力较亲本株低,对雏鸭的致病力、感染鸭血液和组织载菌量及对Vero细胞的黏附和入侵性能均显著或极显著低于亲本株。本试验结果为深入研究鸭疫里默氏杆菌的分子致病机理和研制基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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【目的】获得牛环形泰勒虫(Theileria annulata)新疆株enolase基因,并分析其生物学特性及反应原性。【方法】对牛环形泰勒虫enolase基因进行扩增和克隆,构建原核表达载体pGEX-4T-1-enolase,诱导表达enolase重组蛋白并进行蛋白纯化,通过Western blotting验证enolase重组蛋白反应原性。利用生物信息学方法对enolase基因编码蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、磷酸化、亚细胞定位及蛋白互作网络进行预测分析。【结果】PCR扩增出大小为1 248 bp的牛环形泰勒虫enolase基因片段,enolase重组蛋白大小约70 ku;Western blotting结果表明,该重组蛋白与牛环形泰勒虫阳性血清发生反应。enolase基因编码416个氨基酸,理论等电点为5.91,有38个磷酸化位点;二级结构主要由α-螺旋(43.03%)和无规则卷曲(33.17%)组成;具有17个B细胞抗原表位,亚细胞定位主要位于细胞质中;enolase蛋白与磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、二磷酸核苷激酶(NDK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、热休克蛋白70(HSP70)存在相互作用。【结论】本试验成功克隆出新疆牛环形泰勒虫enolase基因,蛋白互作网络预测其与糖酵解和能量代谢相关的蛋白相互作用。研究结果为牛环形泰勒虫能量代谢途径基因的相关研究奠定基础。 相似文献
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【目的】构建新型猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)乳酸菌活菌疫苗载体。【方法】应用DNA重组技术将嗜酸乳杆菌S-层蛋白(SLP)基因及PEDV S2基因B细胞表位(EpitopeS2)融合基因(SLP-EpitopeS2)克隆到乳酸杆菌表达载体pTRK892中,构建重组载体pTRK-SLP-EpitopeS2,通过电转化方法将重组质粒导入副干酪乳杆菌中,获得重组副干酪乳杆菌。分别用SDS-PAGE、Western blotting和免疫荧光试验(IFA)鉴定目的蛋白在副干酪乳杆菌中的表达。【结果】PCR结果显示,成功扩增出大小为1 400 bp的目的条带,与插入融合基因大小一致,双酶切结果出现大小分别为1 400和4 700 bp的2条带,基因测序结果显示无碱基缺失和突变等,从而确定重组质粒pTRK-SLP-EpitopeS2构建正确。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,在48 ku处出现与理论值大小一致的目的蛋白条带,表明融合基因SLP-EpitopeS2在副干酪乳杆菌中得到有效表达。IFA结果显示,与对照组副干酪乳杆菌相比,重组副干酪乳杆菌均能被激发出特异性绿色荧光信号,与高浓度氯化锂(LiCl)洗脱下来的菌体膜蛋白样品补充鉴定试验结果相吻合。表明融合蛋白SLP-EpitopeS2可能在副干酪乳杆菌的菌体表面表达。【结论】成功构建了PEDV EpitopeS2及嗜酸乳杆菌SLP嵌入型融合表达载体pTRK-SLP-EpitopeS2,为乳杆菌活菌载体疫苗相关研究奠定了基础。 相似文献
14.
【目的】了解河南地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)血清7型流行菌株的毒力及耐药情况。【方法】以Hps血清7型参考菌株为对照,对6株Hps血清7型临床分离菌株进行16S rRNA基因扩增、序列分析、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验研究。【结果】16S rRNA基因测序及相似性比对结果显示,菌株1436与参考菌株0007相似性为100%,菌株1565、1624与参考菌株0007相似性均为98.6%。系统发育树分析表明,菌株1436与参考菌株0007亲缘关系最近;菌株1624与参考菌株0007亲缘关系最远。6株临床菌株与参考菌株表现为2种毒力基因型,菌株均携带有vta1、vta2、vta3、wza、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因,其中5株临床菌株还携带ompP2毒力基因。豚鼠致病性试验结果显示,临床菌株毒力较参考菌株表现出不同程度的增强,参考菌株不能感染豚鼠发病,未表现任何临床症状;临床菌株可感染豚鼠发病,表现出一定的临床症状,发病率为20%~40%,死亡率为0。参考菌株和临床菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感,对强力霉素、氟苯尼考中介,对新霉素、卡那霉素、阿米卡星、红霉素、替米考星等耐药,且均表现出多重耐药现象。【结论】Hps血清7型临床菌株有一定的致病性,但毒力较弱,对头孢类药物敏感,有明显的多重耐药现象,临床上应注意对该血清型的防控。本研究为Hps血清7型流行病学、致病机制研究奠定了基础,为Hps血清7型的临床防控提供了参考依据。 相似文献
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【目的】 试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】 利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1 800 V电压、400 Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】 试验成功获得片段大小为522、539、1 054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】 本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 相似文献
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【目的】 探索噬菌体作为控制养殖环境致病性大肠杆菌的新手段。【方法】 本研究进行了大肠杆菌噬菌体的分离及相应指标评估。通过双层平板法从养殖环境中分离禽致病性大肠杆菌裂解性噬菌体。通过电镜及酶切鉴定、温度及酸碱稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线及其在模拟环境中的杀菌效果对该噬菌体进行综合性评估。【结果】 分离得到的噬菌体具有正多面体的头部和细而长的尾部结构, 头部直径约98 nm, 尾部长约123 nm, 结合酶切鉴定结果初步判定该噬菌体为肌尾科双链DNA噬菌体。该噬菌体的温度耐受范围为37~50 ℃; 酸碱耐受范围为pH 3.0~11.0。当感染复数为0.00001时产生的子代噬菌体滴度最高; 一步生长曲线测定结果显示, 该噬菌体潜伏期为20~40 min, 裂解时间为80~100 min, 裂解量为4 133 PFU/cell。从该噬菌体对模拟环境中宿主大肠杆菌的杀菌效果可看出, 浓度为1×104~1×106 PFU/mL的噬菌体ФECP2-1对液体中目标大肠杆菌作用1~6 h, 杀菌率均在99.9%以上; 浓度为2×104~2×106 PFU/g的噬菌体ФECP2-1对鸡粪中目标大肠杆菌作用5~10 h, 杀菌率均在99%以上, 该噬菌体对鸡粪中目标大肠杆菌杀菌效果略低于对液体中目标大肠杆菌的杀菌效果。【结论】 ФECP2-1符合噬菌体类消毒剂相关特征, 是一株具有良好应用前景的噬菌体, 可作为一种生物消毒剂应用于养殖环境中禽大肠杆菌的防控。 相似文献
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【目的】 探究由霍乱弧菌菌影(Vibrio cholerae ghosts,VCG)和纳米壳聚糖凝胶(Gel)组合制作的一种新型灭活衣原体疫苗复合佐剂是否可增强鹦鹉热衣原体原体(elementary body,EB)灭活抗原诱导动物机体产生的免疫应答。【方法】 将60只7日龄SPF鸡随机分为4个组,分别为:EB＋VCG＋Gel组、EB＋VCG 组、Gel组和EB组。通过滴鼻途径免疫鸡群,免疫2次,每次间隔14 d,免疫后检测鸡血清中IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数、CD4＋/CD8＋T 细胞比例、细胞因子(白介素-4(IL-4)、IL-10、IL-12和干扰素-γ(IFN-γ))含量及攻毒后鸡喉头排菌量和肺脏的病理损伤程度。【结果】 与Gel和EB组相比,EB＋VCG＋Gel和EB＋VCG组IgG 抗体水平、淋巴细胞增殖指数、IFN-γ含量和CD4＋/CD8＋T细胞比值显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。此外,与Gel和EB组相比,攻毒后第12天,EB＋VCG＋Gel组喉头排菌量极显著降低(P<0.01),攻毒后第7天,肺脏损伤评分极显著降低(P<0.01)。【结论】 壳聚糖凝胶、VCG、灭活衣原体 EB 组合构成的新型滴鼻衣原体疫苗经鼻腔接种动物后可刺激动物机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,阻断鹦鹉热衣原体经呼吸道途径传播,防止鹦鹉热衣原体从动物向人群传播。 相似文献
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【目的】 为开发噬菌体"鸡尾酒"制剂防治奶牛乳腺炎提供生物学材料。【方法】 以实验室分离的奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌82为宿主菌,通过点滴法和双层平板法在奶牛场的污水、弃奶和粪便混合物中分离并纯化其噬菌体,通过噬菌斑及透射电子显微镜对该株噬菌体的形态特征进行观察。利用核酸酶处理分析该噬菌体核酸类型,并对其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性、pH稳定性进行研究。【结果】 分离筛选出金黄色葡萄球菌82的裂解性噬菌体P82,电镜下观察其头部为二十面体,大小约为120 nm×83 nm,有一条带可伸缩尾鞘的长尾,长约126 nm,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其核酸类型为双链DNA （dsDNA）。噬菌体P82的最佳感染复数为0.001,对奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌裂解率为36.51%（23/63）,宿主谱较广;其生长潜伏期约为25 min,爆发期约为45 min,裂解量约为74 PFU/cell;在pH 4.0~12.0时活性稳定,在pH 2.0和13.0时则完全失去活性。噬菌体P82热稳定性较高,在70 ℃作用60 min后仍有裂解能力,在80 ℃作用40 min时则失去裂解能力。【结论】 本研究分离的噬菌体P82效价较高、裂解能力强、增殖速度快、噬菌谱广,对不同温度和pH均有较好的耐受度,能作为专一性裂解奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌的噬菌体候选株,可与其他噬菌体混合制成噬菌体"鸡尾酒"制剂用于防治奶牛乳腺炎,为奶牛乳腺炎的噬菌体疗法提供材料。 相似文献
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【目的】 探究大肠杆菌噬菌体BP16对O2血清型禽致病性大肠杆菌感染引起的鸡大肠杆菌病的防治效果, 以及噬菌体BP16的最佳治疗剂量。【方法】 将O2血清型禽致病性大肠杆菌新鲜培养物稀释成5×1010、5×109、5×108、5×107和5×106 CFU/mL 5个浓度梯度, 以测定禽致病性大肠杆菌的半数致死量(LD50), 确定其感染剂量; 选取常用的对革兰阴性菌有抑菌或杀菌作用的药敏纸片进行药敏试验, 筛选出阳性对照药物; 经无菌试验和安全性试验确定噬菌体裂解液的无菌性及安全性, 用于后续试验。将80只雏鸡随机分为5个试验组与3个对照组, 试验组在雏鸡攻毒前后不同时间腹腔注射大肠杆菌噬菌体BP16, 3个对照组分别腹腔注射氟苯尼考、大肠杆菌菌液、生理盐水, 其余条件一致, 连续饲养7 d, 记录雏鸡的死亡率, 评价大肠杆菌噬菌体BP16对大肠杆菌人工感染试验鸡的防治效果。【结果】 O2血清型大肠杆菌的LD50为1.5×108 CFU/mL, 筛选出氟苯尼考作为阳性对照药物, 噬菌体裂解液中无菌, 噬菌体悬液对雏鸡安全, 可用于后续防治试验。雏鸡感染大肠杆菌前6 h使用噬菌体能有效预防大肠杆菌病, 在感染同时至感染后6 h内使用噬菌体, 能有效治疗大肠杆菌病, 且噬菌体治疗效果优于氟苯尼考; 当大肠杆菌攻毒剂量为1.5×108 CFU时, 噬菌体剂量为1.5×109 PFU时治疗效果为最佳。【结论】 大肠杆菌噬菌体BP16对大肠杆菌病具有防治作用, 本研究为进一步应用噬菌体防治大肠杆菌病及开发大肠杆菌噬菌体制剂提供了科学依据。 相似文献