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1.
旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在100~106拷贝·μL-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。 相似文献
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建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10-1～105 copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%～3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PR... 相似文献
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本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合，建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针，建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示，本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性，与其他常见猪病毒性原无交叉反应；同时，该方法具有较高灵敏度，p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷，本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时，PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响；对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知，两者的灵敏度均为102 copies/μL;将多重PMA-q... 相似文献
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为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×101~6.26×108copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×101copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。 相似文献
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为建立一种灵敏、准确且快速检测禽源大肠杆菌的方法,根据禽源大肠杆菌uidA基因的一节特异性保守序列设计引物,建立用于禽源大肠杆菌的荧光定量PCR(qPCR)检验方法,并对其各方面进行评价。试验数据表明所建立的qPCR方法的Ct值与标准品在4.69×102～4.69×109copies/μL范围内存在优良的线性关系,线性相关系数为R2=0.993;该方法标准曲线方程为y=-3.2786x+39.032,熔解曲线表现为单峰,不存在非特异性扩增。对重组质粒标准品的最低检测浓度为4.69×102copies/μL,是普通PCR方法的1000倍。该方法检测临床样本阳性率为68.3%(41/60),普通PCR阳性检出率为23.3%(14/60),阳性检出率高出45%。此次研究建立的检测禽源大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法可用于禽源大肠杆菌的快速诊断,对于禽大肠杆菌病的监测具有重要意义。 相似文献
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非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、Mg2＋浓度和引物、探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60 ℃,Mg2＋终浓度为4 mmol/L,引物、探针终浓度分别为0.8、0.3 μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。 相似文献
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牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原，为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法，本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针，并通过优化反应体系，成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示，该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×108～1×101拷贝/μL之间呈现良好的线性关系，线性相关系数R2=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强，在多个犊牛腹泻相关病原中，只检测出BNeV;敏感性较高，对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×101拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×103拷贝/μL;重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,... 相似文献
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为了研究猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)中的增殖情况，试验首先建立了实时荧光定量PCR方法，并检测该方法的敏感性、特异性和重复性，然后利用建立的实时荧光定量PCR方法和病毒半数组织感染量(TCID50)方法测定并比较猪JEV在BHK-21细胞中的增殖规律。结果表明：建立的猪JEV实时荧光定量PCR检测方法的扩增效率为99.3%,敏感性、特异性和重复性良好，检测敏感性可以达到1.0×101 copies/μL;TCID50方法测定的细胞悬液和细胞培养上清液中的病毒含量分别为1.0×105.44 TCID50/0.1 mL和1.0×104.86 TCID50/0.1 mL,实时荧光定量方法测定的病毒粒子数量分别为1.0×107.50 copies/μL和1.0×105.60 copies/μL,两种方法在细胞悬液中... 相似文献
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依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。 相似文献
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致泻性大肠杆菌可引起大熊猫血水样便、休克，严重者可危及生命。为准确鉴定4种致泻性大肠杆菌病原，本研究通过对引物浓度、退火温度、反应条件等进行优化，建立了能同时检测EPEC和EHEC的多重PCR方法以及ETEC和EAEC的多重PCR方法。结果得出：两种多重PCR方法特异性强，仅对特有的毒力基因进行扩增，对其他10种大熊猫源病原菌的扩增结果均为阴性；敏感性较高，细菌基因组DNA检测中EHEC和EPEC的检测下限为2.71×104拷贝/μL,EAEC的检测下限为3.23×104拷贝/μL,ETEC的检测下限为3.23×103拷贝/μL；菌液检测中EPEC和EHEC的检测下限为1.85×104CFU/mL,ETEC的检测下限为2.9×103CFU/mL,EAEC的检测下限为2.62×104CFU/mL；不同时间段重复8次，均扩增出对应的目的条带，证明重复性好。利用多重PCR和单一PCR方法分别检测110份样品，结果得出esc V基因阳性率为1.82%(2/110)... 相似文献
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）,针对ASFV B646L （p72）基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。 相似文献
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采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统，建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列，选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物，并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化，建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取105～1 copies·μL-1含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明，本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏，其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL-1)2.0μL、crRNA(100μmol·L-1)3.2μL、TaqMan... 相似文献
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为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法，根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针，通过优化反应条件，建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示，该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×109—1.019×102copies/μL时，相关系数R2为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系；与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应，最低检测限度为10.19 copies/μL，组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测，两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20)，两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明，本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。 相似文献
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为了建立一种快速检测猪伪狂犬病病毒(PRV)经典毒株和变异毒株的双重实时荧光定量PCR方法，试验根据GenBank上收录的30株PRV设计gE基因和gC基因的特异性引物和探针，构建含有gE基因和gC基因的标准质粒，优化扩增体系建立双重实时荧光定量PCR方法，并检验该方法的特异性、敏感性和重复性，同时绘制标准曲线，最后采用该方法对临床样品进行检测。结果表明：试验建立的双重实时荧光定量PCR方法的最佳退火温度是60℃,最佳引物体积为0.8μL,最佳探针体积为0.4μL。该方法对猪场常见疫病病原猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应，特异性强；对两种标准质粒pUC57-gE和pUC57-gC的最低检测限均为1×101copies/μL,gE基因和gC基因对应的标准曲线分别为y=-3.446x+41.920(R2=0.998)和y=-3.255x+39.185(R2... 相似文献
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为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法，本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物，通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示：该方法在37℃反应40 min检测效果最佳。采用该方法对ORFV、山羊痘病毒、O型和A型口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型等临床常见症状相似的病毒核酸检测，结果显示：该方法除对ORFV的检测结果为阳性外，对羊的其他病毒的检测结果均为阴性，特异性较强。将质粒标准品10倍倍比稀释(1×109拷贝/μL～1×100拷贝/μL)后为模板，利用本研究建立的RAA方法检测，结果显示：该方法对ORFV质粒标准品的最低检测限为1×104拷贝/μL，敏感性较高。利用本研究建立的方法对95份临床样品(15份组织样品和80份血液样品)检测，结果显示：该RAA方法能够对临床样品快速检测，组织样品和血液样品的阳性率分别为33.33%(5/15)和6.25%(5/80)，该检测结果与普通PCR检测方法的符合率均为... 相似文献
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为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病... 相似文献
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旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示：自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL-1,敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×101 copies·μL-1);模板浓度为1... 相似文献
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《中国兽医杂志》2016,(10)
基于非洲猪瘟病毒(ASFV)CP204L基因序列设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种检测ASFV的TaqMan-MGB实时荧光PCR方法。结果显示,该方法仅对ASFVDNA呈现特异性扩增,不与猪的其他常见病毒发生交叉反应,具有良好的特异性。该方法对标准对照质粒(PCR2.1-CP204L)的线性检测范围为4.2×10~1~4.2×10~9copies/μL,标准曲线方程为Y=-3.452 3X+39.014,相关系数(R~2)为0.998 8,检测下线为4.2个拷贝。对5个不同浓度(4.2×10~3~4.2×10~7copies/μL)的质粒标准品进行4次双份样品的重复检测,Ct值变异系数均小于1.5%,表明该方法具有良好的重现性。用该方法对总计164份的进口猪临床样品和生猪肌肉样品进行ASFV检测,结果均为阴性。该方法的建立为活猪临床样品和生猪肌肉样品中ASFV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 相似文献