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1.
为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA.通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系.间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达.JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台. 相似文献
2.
为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。 相似文献
3.
《中国兽医学报》2017,(3):420-425
试验证明绵羊透明质酸酶2(hyaluronidase 2,Hyal-2)可以作为绵羊肺腺瘤病毒的受体与绵羊表面蛋白(surface protein,SU)亚基结合。为了进一步研究绵羊Hyal-2与SU蛋白可能结合的区域,运用生物信息学软件预测了SU蛋白的膜外区部分,然后分别构建了一系列缺失型真核表达载体,将缺失型SU蛋白真核表达载体pEGFP-C1-(su1~su5)转染293T细胞,激光共聚焦显微镜观察结果显示:SU1-SU5融合蛋白定位于细胞质,Western blot结果显示在66 000处出现阳性条带,表明成功构建了SU蛋白缺失型真核表达载体。 相似文献
4.
为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系.采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞.通过G418筛选,对转染阳性细胞进行纯化,获得稳定表达JSRV SU蛋白的A549细胞系.以间接免疫荧光及western blot鉴定SU的表达状况,并运用共聚焦显微镜确认SU蛋白的亚细胞定位.结果表明,重组蛋白SU在A549细胞中有效表达,而且主要分布于细胞质中.该细胞系的建立为SU生物学功能的体外研究提供了平台. 相似文献
5.
《动物医学进展》2016,(4)
试验证明绵羊的Hyal-2不仅可以与绵羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白Env结合,也可以单独与绵羊肺腺瘤病毒SU蛋白亚基结合。为了进一步研究绵羊Hyal-2与SU蛋白可能结合的区域,应用在线生物学软件预测了SU蛋白的膜外区(对应编码基因序列238bp~867bp)将之前已经构建的缺失型SU蛋白真核表达载体pEGFP-C1-(su1-su5)与pDsRed-monomer-N1-hyal-2共转染293T细胞,运用激光共聚焦方法结合免疫共沉淀方法确定SU蛋白和Hyal-2蛋白可能结合区域。激光共聚焦显微镜观察结果表明,SU1-SU5与Hyal-2均存在细胞内共定位。免疫共沉淀方法检测缺失型蛋白SU1-SU5与绵羊Hyal-2均不存在相互作用。su基因所缺失区域238bp~867bp对于SU蛋白与受体的结合都是必不可少的。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2017,(5):898-904
通过探索JSRV Env真核表达质粒诱导转染小鼠NIH 3T3(小鼠成纤维细胞)后对血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响,进一步探讨其变化与绵羊肺腺瘤病(OPA)肿瘤发生的关联性。首先体外培养NIH 3T3细胞,设立转染pEGFP-C1-env、pEGFP-C1及未转染细胞组。本研究采用实时荧光定量PCR方法检测VEGF和EGFR mRNA水平上的表达;ELISA方法检测两细胞因子在不同处理的NIH 3T3细胞培养上清中蛋白的表达。结果显示,相比pEGFP-C1和未转染细胞组,转染pEGFP-C1-env细胞组中VEGF和EGFR mRNA的表达量均显著升高(P<0.05);且在该处理组的细胞培养上清中检测到VEGF和EGFR蛋白浓度呈明显上升趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。转染pEGFP-C1细胞组相比未转染细胞组VEGF和EGFR mRNA和蛋白表达量均差异不明显(P>0.05)。结果表明,JSRV Env在诱导转染小鼠NIH 3T3细胞转化过程中,通过qPCR和ELISA的检测结果均可得知VEGF和EGFR表达量均升高,由两者的过表达变化推测VEGF和EGFR在OPA肿瘤发生过程中可能起关键作用,同时为OPA针对两者进行的基因靶向治疗方法提供理论基础。 相似文献
7.
为了制备特异性的抗绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV) 内蒙株衣壳蛋白(CA)的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系,以原核表达CA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合,同时以表达蛋白作为包被抗原进行特异性ELISA检测,共筛选到6株阳性杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆后,最终得到了5株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株;再利用CA真核表达蛋白以间接免疫荧光法,对此5株杂交瘤细胞进行进一步的特异性鉴定。结果显示,有3株具有特异性强荧光反应,也能检测到目的基因的表达产物。本试验获得了3株稳定分泌抗JSRV-NM株CA蛋白McAb的杂交瘤细胞系,为建立检测病原的特异性诊断方法、分析JSRV-NM株CA蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位等奠定基础。 相似文献
8.
《中国畜牧兽医》2016,(9)
通过脂质体法将JSRV-Env重组质粒瞬时转染小鼠肺上皮细胞(TC-1)和表达绵羊Hyal-2的小鼠肺上皮细胞(TC-1-Hyal2),而后探讨两细胞中转化生长因子-α(TGF-α)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白表达的变化,以此分析TGF-α、VEGF与绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)发生的关联性及其在细胞癌变过程中的作用。体外培养TC-1和TC-1-Hyal2细胞,按照不同质粒可将TC-1和TC-1-Hyal2细胞分别设为pEGFP-C1-env转染组、pEGFP-C1转染组和未转染组。利用实时荧光定量PCR和ELISA方法对TGF-α、VEGF的表达水平进行检测。实时荧光定量PCR检测结果表明,相比对照组(pEGFP-C1转染组及未转染组),在转染pEGFP-C1-env的两细胞组中VEGF mRNA的表达量均显著升高(P0.05);而两细胞组中TGF-αmRNA的表达量均极显著升高(P0.01)。ELISA检测结果表明,同两对照组相比,转染pEGFP-C1-env的TC-1-Hyal2细胞上清液中VEGF、TGF-α蛋白浓度均极显著升高(P0.01);且VEGF在相同转染处理的TC-1细胞组中其蛋白浓度也极显著升高(P0.01),而TGF-α的蛋白浓度呈显著升高(P0.05)。比较pEGFP-C1转染和未转染各细胞组中TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量,结果均无显著差异(P0.05)。本研究发现,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测经JSRV-Env诱导转染上述两细胞系后TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量均升高,结果提示JSRV-Env可能上调两细胞因子,进而可推测TGF-α、VEGF的表达变化与OPA发病存在一定的关联性,由此为衍生出的OPA针对二者进行基因靶向治疗方案提供重要的理论依据。 相似文献
9.
《动物医学进展》2021,42(9)
利用已构建的JSRV Env慢病毒载体转染绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs),探讨Akt/mTOR信号通路的激活及其对细胞增殖的影响。以STCs为空白组,空病毒载体转染STCs为对照组,JSRV Env慢病毒载体转染STCs为试验组,通过Western blot检测Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白的表达,并在JSRV Env转化细胞中加入mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin),利用噻唑蓝(MTT)比色法比较分析细胞增殖情况。激光共聚焦观察显示JSRV Env慢病毒转染STCs 72 h后,因稳定表达了Env蛋白而出现大量红色荧光信号;Western blot结果显示,与空白组和对照组相比,试验组有p-Akt和p-mTOR的显著表达(P0.05);MTT比色法分析结果显示,与空白组和对照组相比,试验组的细胞增殖能力显著上调(P0.05)。JSRV Env转化细胞中加入雷帕霉素后,MTT比色法分析结果显示,与JSRV Env慢病毒转染STCs组相比,细胞增殖能力显著下调(P0.05);Western blot结果显示,雷帕霉素作用72 h后mTOR表达显著下调(P0.05)。综上可知,JSRV Env慢病毒激活了STCs中的Akt/mTOR信号通路,参与调控细胞增殖。研究结果为进一步探究JSRV Env诱导细胞转化、参与细胞增殖等生物学作用的探讨提供了基础的参考资料。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2017,(5)
本试验旨在进一步全面研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白ENV的功能。使用本试验室已构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/exJSRV-env转染NIH3T3细胞,并将此NIH3T3细胞接种到裸鼠体内;重组质粒经尾静脉注射到幼龄BALB/c小鼠体内。结果显示,真核表达质粒pcDNA3.1(+)/exJSRV-env引起NIH3T3细胞发生转化,转染细胞接触抑制性消失,并形成大量的转化灶;pcDNA3.1(+)/exJSRV-env转染的NIH3T3细胞接种裸鼠使裸鼠致瘤,即引起NIH3T3细胞发生癌变。JSRVenv基因在小鼠体内表达,肝脏细胞出现大面积弥散性坏死,脾脏白髓严重坏死,心肌细胞明显颗粒样变性,肺间质细胞增生,肾小管上皮细胞轻度颗粒样变性。结果表明,绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白可以引起鼠NIH3T3细胞发生转化和癌变,使小鼠各脏器出现不同程度的病变。本试验为进一步探索JSRV ENV的致瘤机制奠定基础。 相似文献
11.
为了明确绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白(Env)的致瘤作用,将重组真核表达质粒pEGFP-C1/exJSRVenv和pEGFP-C1/enJSRV-env分别转染到永生化绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs)中,筛选最佳转染条件并利用软琼脂集落形成试验检测是否引起细胞的恶性转化;用平板克隆试验检测囊膜蛋白的表达对细胞增殖的影响。结果显示:在STCs中转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒后细胞在软琼脂中生长并产生集落,同时表现细胞接触抑制性消失;转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒的STCs则表现为不能在软琼脂中产生集落;平板克隆试验结果经SPSS软件分析,转染pEGFP-C1/exJSRV-env的绵羊绒毛膜滋养层细胞的克隆形成率显著高于转染pEGFP-C1/enJSRV-env细胞、pEGFP-C1空载体的细胞以及未转染的细胞(P0.01)。exJSRV-Env的表达可以诱导STCs发生恶性转化以及细胞增殖。本试验可以为进一步探讨绵羊肺腺瘤逆转录病毒囊膜蛋白的功能提供理论依据,并为研究绵羊肺腺瘤病的致瘤机制提供新思路。 相似文献
12.
《畜牧兽医学报》2015,(5)
为制备抗绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白(ENV)胞质尾区(CT)的单克隆抗体,利用生物信息学分析JSRV囊膜蛋白氨基酸序列,根据分析结果合成多肽,将此多肽分别连接钥孔血蓝蛋白(CT-KLH)和牛血清白蛋白(CT-BSA),用CT-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌抗CT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌抗CT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为8E5,亚类为IgG2a/κ。间接ELISA检测培养上清效价为6.4×103,腹水效价为1×105。Western blot及免疫组化结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别JSRV抗原,与其发生特异性反应。试验结果证明,单抗8E5是绵羊肺腺瘤的重要诊断试剂。应用8E5细胞株分泌的单克隆抗体建立JSRV-ENV的双抗体夹心ELISA检测方法,该ELISA检测方法特异性、重复性和敏感性良好,为快速检测诊断绵羊肺腺瘤和研究囊膜蛋白功能奠定了基础。 相似文献
13.
《中国兽医学报》2017,(7):1316-1321
通过比对人、鼠、兔和牛的Nanog启动子保守区设计引物,PCR扩增绵羊Nanog基因启动子序列并分析其调控位点。将其连接到去掉自身CMV启动子的pAcGFP1-N1载体上,构建一个由Nanog启动子带动的真核表达载体(SNanog-pAcGFP1-N1),即构建一个能由该启动子序列带动并产生绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,并用脂质体法转染入终末分化细胞(小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞)、胚胎干细胞和小鼠胚胎,检测其表达活性。结果显示:成功克隆出1 836bp Nanog启动子序列,通过分析发现该序列含有SP1结合位点、CAAT框、TATA框等功能区;当转染SNanog-pAcGFP1-N1重组质粒后,小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞中能检测到绿色荧光,且在转染72h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中不能观察到GFP。结果表明:本试验成功克隆获得绵羊Nanog启动子,所构建的真核表达载体具有在多能干细胞中特异性表达活性。 相似文献
14.
为了构建绵羊透明质酸酶-2(hyaluronidase 2,Hyal-2)的真核表达载体并实现其在牛乳腺上皮细胞内瞬时表达,根据GenBank中绵羊Hyal-2基因序列(登录号:NM_001009754)设计2对引物,并分别在前段上游和后段下游引物5'端引入HindⅢ酶切位点和BamHⅠ酶切位点,同时在上游引物酶切位点后加入KOZAK序列,进行分段PCR扩增。以扩增的两段产物为共同模板运用重叠(overlapping)PCR技术扩增Hyal-2基因全长。通过连接反应将双酶切并纯化后的目的片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1上,并通过脂质体转染法将构建好的真核表达载体转染牛乳腺上皮细胞,运用RT-PCR及Western blotting方法分别从核酸及蛋白质水平验证其表达。经测序分析,目的片段与模板核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为99%,且片段插入方向正确。RT-PCR及Western blotting方法检测均出现目的条带,证明成功构建了绵羊透明质酸酶-2的真核表达载体,并在牛乳腺上皮细胞中获得表达。 相似文献
15.
通过脂质体法将JSRV-Env重组质粒瞬时转染小鼠肺上皮细胞（TC-1）和表达绵羊Hyal-2的小鼠肺上皮细胞（TC-1-Hyal2）,而后探讨两细胞中转化生长因子-α（TGF-α）及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达的变化,以此分析TGF-α、VEGF与绵羊肺腺瘤病（ovine pulmonary adenomatosis,OPA）发生的关联性及其在细胞癌变过程中的作用。体外培养TC-1和TC-1-Hyal2细胞,按照不同质粒可将TC-1和TC-1-Hyal2细胞分别设为pEGFP-C1-env转染组、pEGFP-C1转染组和未转染组。利用实时荧光定量PCR和ELISA方法对TGF-α、VEGF的表达水平进行检测。实时荧光定量PCR检测结果表明,相比对照组（pEGFP-C1转染组及未转染组）,在转染pEGFP-C1-env的两细胞组中VEGF mRNA的表达量均显著升高（P<0.05）;而两细胞组中TGF-α mRNA的表达量均极显著升高（P<0.01）。ELISA检测结果表明,同两对照组相比,转染pEGFP-C1-env的TC-1-Hyal2细胞上清液中VEGF、TGF-α蛋白浓度均极显著升高（P<0.01）;且VEGF在相同转染处理的TC-1细胞组中其蛋白浓度也极显著升高（P<0.01）,而TGF-α的蛋白浓度呈显著升高（P<0.05）。比较pEGFP-C1转染和未转染各细胞组中TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量,结果均无显著差异（P>0.05）。本研究发现,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测经JSRV-Env诱导转染上述两细胞系后TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量均升高,结果提示JSRV-Env可能上调两细胞因子,进而可推测TGF-α、VEGF的表达变化与OPA发病存在一定的关联性,由此为衍生出的OPA针对二者进行基因靶向治疗方案提供重要的理论依据。 相似文献
16.
为了提高绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2(Hyal-2)在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量,试验对含pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒的BL21(DE3)重组菌原核表达条件进行了优化。结果表明:诱导剂IPTG浓度、作用时间、温度对目的蛋白的表达影响很大,在37℃条件下加入不同终浓度的IPTG(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)对重组菌诱导4 h,在终浓度为0.4 mmol/L时目的蛋白的表达量最高;加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,在37℃条件下诱导,在不同时间点(2,4,6,8小时)取样,在作用时间为2 h,37℃条件下表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在,当温度降低时可溶性形式明显增加。通过对诱导条件的优化和摸索发现,绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2原核表达在诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L、作用时间为2 h、温度为37℃时目的蛋白的表达量最高。 相似文献
17.
《畜牧兽医学报》2017,(5)
旨在建立能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。本研究利用NCBI已公布猪GM-CSF基因序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出猪GM-CSF开放阅读框(ORF)。发现其长435bp,编码144个核苷酸的蛋白。该蛋白分子质量为16.3ku,等电点为7.15。与绵羊、马、猫、牛、狗和人的同源性分别为77.1%、73.6%、72.2%、71.5%、71.3%和70.8%。通过EcoR I和BamH I酶切后,将GM-CSF基因插入pIRES2-EGFP载体中,构建出pIRES2-EGFP-pGM-CSF重组质粒。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,G418筛选阳性细胞。在转染后24h,荧光定量PCR可见GM-CSF mRNA表达量较对照组及空载体组细胞显著升高(P0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在含有G418的培养液中连续传代30次,仍可见GM-CSF基因和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-pGM-CSF和能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。 相似文献
18.
为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。 相似文献
19.
为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础. 相似文献