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为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理,利用PCR技术从白桦幼叶cD-NA中克隆出BpFLC和BpSVP基因序列,利用NdeⅠ和Eoc RⅠ限制性内切酶将BpFLC和BpSV P分别整合进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中。 pGBKT7－BpFLC及pGBKT7－BpSVP转化酵母Y2Hgold菌株显示无自激活与毒性作用。酵母Y2Hgold [ pGBKT7－BpFLC ×pGADT7－B pSVP]、Y2Hgold [ pGADT7－BpFLC ×pGBKT7－BpSVP]均可在QDO／A／X平板上生长,并显示蓝色,说明能激活报告基因HIS3、ADE2、AUR1－C 、MEL1,由此表明BpFLC与BpS-VP蛋白能够结合,存在互作关系。 相似文献
2.
利用酵母双杂交系统鉴定甘蓝SCR与SRK胞外域片段间的相互作用 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]利用酵母双杂交系统鉴定甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域(eSRK)片段间可能的相互作用区域.[方法]以结球甘蓝B3为材料,利用分子克隆技术,分别构建以pGBKT7为载体的全长SCRB3、SCRB3-1、SCRB3-2的重组诱饵质粒;以pGADT7为载体的全长eSRKB3、eSRKB3-1、eSRKB3-2的重组激活域(AD)质粒.用PEG/LiAc法将上述重组诱饵质粒转化感受态酵母菌Y2HGold,重组AD质粒转化感受态酵母菌Y187;Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-s]、Y187[pGADT7-eSRKB3-s]两两融合培养,观察交配菌在SD/-Trp-Leu/x-α-ga1/AbA(DDO/x/A)、SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal/AbA(QDO/x/A)平板上的生长情况.[结果]酵母双杂交重组表达载体构建成功,且无毒性和自激活作用产生;9个试验组中只有SCRb3-1、SCRb3-2与eSRKBb3-1、eSRKb3-2重组表达质粒转化子两两组合的4个融合株在QDO/x/A平板上出现蓝色克隆,激活了报告基因AUR1-C MEL1、HIS3、ADE2.[结论]酵母双杂交系统适用于SCR与SRK蛋白相互作用的研究,初步确定了SCR与eSRK存在相互作用,SRK跨膜域的存在与否对其相互作用的研究没有影响. 相似文献
3.
《山西农业大学学报(自然科学版)》2022,(1)
[目的]探究葡萄WDR1蛋白的作用机理,丰富原花青素和花青苷物质合成调控机理。[方法]采用PCR技术克隆葡萄WDR1基因CDS区,运用生物信息学分析对其编码蛋白理化性质、亲疏水性、信号肽及跨膜结构域、二级结构、三级结构、保守结构域等进行预测;将VvWDR1的CDS全长克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,转化酵母感受态细胞并进行毒性及自激活检测分析;通过酵母双杂系统对葡萄WDR1与MYBPA2、MYC2蛋白互作机制进行研究。[结果]WDR1基因cDNA全长1 011 bp,编码366个氨基酸,分子量37.8 kD,等电点5.07,分子式为C1671H2588N458O518S11;无信号肽且不具有跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构中无规则卷曲39.29%,β-折叠26.79%,α-螺旋22.02%,β-转角11.90%;该蛋白含有5个WD40基序。同时对葡萄WDR1蛋白进行系统进化分析,发现与PhAN11、AtTTG1的同源性较高;成功构建表达载体pGBKT7-WDR1、pGBKT7-MYC2、pGADT7-MYC2,并鉴定出VvWDR1在酵母细胞中无自激活活性且无毒性;酵母双杂交试验结果显示,共转化pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYBPA2与pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYC2的酵母菌可以在SD/-Trp-Leu-His-Ade的四缺培养基上正常生长。[结论]克隆得到葡萄WDR1基因,对其进行生物信息学分析,且通过酵母双杂交证明VvWDR1与VvMYBPA2、VvMYC2编码的蛋白之间存在相互作用。 相似文献
4.
[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶(Leucine rich repeat receptor protein kinase) OsRPK1胞外结构域的互作蛋白.[方法]以日本晴水稻为研究材料,以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD(969 bp).将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-OsRPK1-OD.[结果]对pGBKT7-OsRPK1-OD进行毒性检测和转录自激活鉴定,酵母生长结果发现,含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold细胞,在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-gal/AbA固体培养基上生长受到抑制;在SD/-Trp生长出含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致,显示插入的OsRPK1-OD对酵母生长无毒性作用.[结论]OsRPK1-OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质. 相似文献
5.
[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。 相似文献
6.
T1083替换融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母的自激活试验（摘要）（英文） 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]研究T1083替换融合质粒载体pGBKT7-Ts转入酵母的自激活实验,探讨其表达产物是否可作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[方法]将T1083替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母后,进行自激活和蛋白表达毒性检测试验。pGBKT7-TS对报告基因自主激活的检测。将pGBKT7-TS质粒转染S.cerevisiae strainAH109和S.cerevisiaeY187菌株,同时分别转入pGBKT7作为对照,在SD-Trp平板上挑取转化菌落,悬于适量无菌水中,再分别接种于SD-Trp ＋X-α-gal、SD-Trp-His ＋X-α-gal、SD-Trp-Ade ＋X-α-gal和SD-Trp-Ade-His ＋X-α-gal平板。30℃培养2 ～3 d,观察各平板菌落颜色。确定含有pGBKT7-TS质粒的AH109和Y187酵母细胞内HIS、ADE、Mel1、LacZ报告基因的表达情况。pGBKT7-TS对酵母AH109和Y187的毒性检测、挑取大于2 mm的pGBKT7-TS转化的AH109克隆和pGBKT7-TS转化的Y187克隆各1个,分别接种于50 ml SD/-Trp＋Kan（20μg/ml）培养基中,30℃、250 r/min培养16 h,检测OD600,若OD600〈0.8,则DNA-BD可能有毒性;若OD600≥0.8,说明DNA-BD无毒性。[结果]转化pGBKT7-TS的酵母菌AH109在SD-Trp ＋X-α-gal平板和SD-Trp-His ＋X-α-gal平板上均可长出菌落,但在SD-Trp-Ade ＋X-α-gal平板和SD-Trp-Ade-His＋X-α-gal平板上均无菌落生长,表明转入pGBKT7-TS后His报告基因有泄漏表达,但不能激活ADE和MELI报告基因。毒性检测试验中,重复2次,其OD600均大于0.8,说明DNA-BD融合蛋白对酵母AH109和Y187的生长无毒性,可以作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了试验基础。 相似文献
7.
【目的】检测猪红细胞类补体受体I型（Complement receptor 1-like,CR1-like）与C3b活性片段能否发生结合,以期为阐明猪红细胞发挥免疫粘附功能的分子机理提供科学数据。【方法】利用前期已构建的CR1-like(3-6)、CR1-like(8-11)功能域片段的重组质粒建立酵母双杂交检测体系,运用酵母共转化的方法将诱饵质粒（重组pGBKT7-CR1-like）与捕获质粒（重组pGADT7-C3b）共同转入Y2HGold酵母细胞中,分别利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）严格筛选共转化成功的酵母细胞,再根据报告因子是否表达来鉴别转化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培养板上的生长情况,并结合菌落的颜色变化现象综合判定CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞中是否发生相互结合;然后运用免疫沉淀技术分离酵母细胞中CR1-like与C3b结合复合物,并对该复合物的特异性进行Western blot鉴定。【结果】试验成功将pGBKT7-CR1-like与pGADT7-C3b基因共转入Y2HGold酵母细胞。共转化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能够正常生长,在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生长且菌落呈现蓝色,由此表明,试验中酵母双杂交系统建立成功,并通过试验获得了阳性酵母克隆。共同转化了pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b质粒的酵母菌落PCR反向鉴定结果显示,在共转化的酵母菌中含有目的基因CR1-like(3-6)和CR1-like(8-11),共转化组的质粒酶切后出现C3b基因片段,与设计大小一致,说明重组质粒成功共转化入酵母细胞中。免疫沉淀试验中应用pGBKT7载体的标签抗体c-Myc沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以c-Myc为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以HA单克隆抗体为一抗进行Western blot检测时,在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,只有3、4泳道中共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在CR1-like与C3b识别结合的复合物。使用CR1-like单克隆抗体沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以CR1-like单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以C3单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,泳道3、4所示只有共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在具有生物活性的CR1-like与C3b识别结合的复合物。通过多个单克隆抗体杂交结果,可看出诱饵质粒的表达产物CR1-like(3-6)、CR1-like(8-11)片段与捕获质粒的表达产物C3b片段可在酵母细胞内发生结合。【结论】猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的识别配体为C3b,为猪红细胞CR1-like功能域分子结构的进一步解析提供了重要数据依据。 相似文献
8.
筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达. 相似文献
9.
《山西农业大学学报(自然科学版)》2018,(12)
[目的]生物信息学分析葡萄DFR蛋白的功能结构域和蛋白互作预测,构建DFR酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。[方法]利用NCBI中的CDD分析DFR蛋白保守区域,STRING在线软件对DFR蛋白互作情况进行预测,采用PCR技术扩增出葡萄DFR基因,克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,PEG/LiAc法将阳性质粒pGBKT7-DFR转化至酵母AH109中,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。[结果]DFR蛋白保守区域有NADP结合位点,预测到DFR蛋白与MybPA1蛋白有互作关系。成功构建了诱饵载体pGBKT7-DFR,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。[结论]本研究通过生物信息学分析得出,酵母诱饵蛋白表达载体pGBKT7-DFR,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与DFR相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。 相似文献
10.
新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。 相似文献
11.
[目的]构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础.[方法]采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析.[结果]构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU,文库滴度为3.1×108 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000 bp,重组率为91.67%.以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9).[结论]通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据. 相似文献
12.
《西南农业学报》2016,(8)
应用酵母双杂交体系,构建凡纳滨对虾IHHNV 3个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体,并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测,为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾IHHNV病毒3个开放阅读框的基因片段进行PCR特异性扩增,并运用In-Fusion技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7进行连接,获得重组质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2,并进行自激活和毒性检测。结果表明,pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2等3个重组质粒对MEL1报告基因无自激活性;对AUR1-C报告基因无自激活作用,pGBKT7-CP,pGBKT7-NS1,pGBKT7-NS2和空载体的酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD_(600)均大于0.8,说明诱饵载体无毒性且不具自主激活报告基因的功能,所获得的无自激活作用的诱饵载体可用于酵母双杂交试验。 相似文献
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【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的，给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子，在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒（RGSV）沉默抑制子P5互作的寄主蛋白，为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础，为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因，将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上，利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中，通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-LeuTrp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中，先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/... 相似文献
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为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础. 相似文献
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采用巢式PCR获得甘蓝SCR的成熟肽编码区,利用同源重组技术首次将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-SCR,结果表明:通过巢式PCR获得了正确的甘蓝SCR成熟肽编码区,并成功构建到pGBKT7诱饵载体中,且转化有诱饵载体的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,而在SD/-His-Trp和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷平板上皆不能生长,说明对报告基因无自激活作用;且毒性实验也表明,SCR蛋白对酵母没有毒害作用. 相似文献
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[目的]构建诱饵载体pGBKT7-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性。[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测。[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确。自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用。[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cD-NA文库筛选奠定基础。 相似文献
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OguCMS是甘蓝中应用最为广泛的雄性不育类型,前期表达谱分析表明转录因子BoMYB1在OguCMS花药中表达下调达10.3倍。通过构建酵母双杂交转录因子BD区诱饵载体pGBKT7-BoMYB1,将其转入酵母菌AH109中进行转录因子BoMYB1转录激活功能的分析。结果显示,AH109[pGBKT7-BoMYB1]在SD/-Trp/x-a-gal、SD/-Ade/-Trp/x-a-gal、SD/-His/-Trp/x-a-gal平板上均长出蓝色菌落,表明BoMYB1可以自主激活报告基因ADE2、HIS3和MEL1,说明转录因子BoMYB1具有转录自激活功能。研究结果对于深入探索该基因的功能及阐明OguCMS花药败育的机理具有重要意义。 相似文献
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【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。 相似文献
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为构建小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体,并检测其对酵母细胞的自激活作用.利用RT-PCR扩增Ta Trx-h基因的ORF区域,并与pGBKT7载体连接构建诱饵载体pGBKT7-Trx-h,利用PEG/LiAC法转化酵母AH109后,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无自激活作用.结果表明,含pGBKT7-Trx-h质粒的酵母在SD/-Trp-Leu培养基上能正常生长,说明诱饵载体表达产物对酵母细胞无毒性作用;在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上不能生长,说明诱饵质粒无自主激活报告基因的作用.因此,可以利用该诱饵载体通过酵母双杂交方法筛选与Trx-h蛋白相互作用的蛋白. 相似文献