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SUMO(small ubiquitin-like modifier)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme)是SUMO修饰靶蛋白过程中唯一的E2结合酶,在SUMO修饰过程中发挥关键作用。本研究克隆了家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)NbUbc9基因的完整开放阅读框。序列分析表明,NbUbc9与所有来源于微孢子虫属(Nosema)的Ubc9聚类在同一大分支上,与同为Nosema属的西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)Ubc9同源性最高,说明NbUbc9蛋白在进化上高度保守。qRT-PCR分析表明,家蚕内源性Ubc9的表达量在Nb感染后有所下降,而Nb自身NbUbc9的表达显著增加。对NbUbc9基因RNAi后,Nb基因组DNA的复制水平显著下降,说明NbUbc9在Nb的细胞增殖中起着关键作用。经Pull-down和质谱分析,初步鉴定出有46个家蚕蛋白和8个Nb蛋白可能与NbUbc9相互作用,涉及蛋白质折叠与转运、去泛素化、信号转导等。研究结果为进一步研... 相似文献
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烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。 相似文献
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层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的黏附等方面都有重要作用。通过检索微孢子虫数据库发现家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)存在假定层粘连蛋白基因Nb HLAMB4,根据该基因序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了Nb HLAMB4基因。该基因的开放阅读框(ORF)全长为1 104 bp,预测编码的蛋白质含有367个氨基酸,分子质量为43.74 k D,等电点为5.72。Nb HLAMB4蛋白序列含有一个N-糖基化位点和Pfam:SAS-6_N结构域,无信号肽,也无跨膜结构域。应用酵母双杂交技术,以Nb HLAMB4作为诱饵蛋白,通过筛选家蚕中肠c DNA文库,初步得到3个与Nb HLAMB4互作的候选蛋白质,分别是家蚕热休克蛋白(Hsp40)、锌指蛋白420类似物(similar to zinc finger protein 420)、氨肽酶N(aminopeptidase N)。研究结果为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制提供了新的线索。 相似文献
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《蚕业科学》2017,(1)
选择家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白质谱数据库中新发现的假定表面蛋白NBO_33g0013进行研究,了解该蛋白质的功能及是否参与微孢子虫对宿主细胞的侵染过程。预测该蛋白质分子质量为26.1 k D,等电点为4.59,其序列N端具有信号肽,无跨膜螺旋结构,含3个N-糖基化位点,无O-糖基化位点,不具有典型的功能结构域,与柑橘凤蝶微孢子虫(Papilio xuthus)的一个假定蛋白序列相似度达到93%。以家蚕微孢子虫CQ1分离株的基因组DNA为模板克隆该蛋白质的编码基因,构建重组表达载体进行该蛋白质的原核表达,并制备获得多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析确证该蛋白质定位在家蚕微孢子虫孢子表面。经体外细胞感染实验初步分析,尚未发现该蛋白质参与了微孢子虫孢子对宿主Bm E细胞的粘附过程,推测该蛋白质可能为家蚕微孢子虫孢壁的结构组成型蛋白质,在孢壁的构架形成中发挥作用。 相似文献
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海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的开放阅读框长1 386 bp,为单外显子结构,编码461个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量53.7 k D,等电点5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1个糖基转移酶结构域和4个潜在的N-糖基化位点,亚细胞定位预测该蛋白质位于细胞质中。多重序列比对分析结果表明,Nb TPS1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分别为59.0%、54.7%,系统发育进化树显示三者的亲缘关系与之相符。构建重组表达载体Nbtps1/p ET-28a(+)并转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及亲和纯化后获得最终质量浓度为1.18 mg/m L的重组融合蛋白His-Nb TPS1。用纯化后的融合蛋白制备兔多克隆抗体Anti-Nb TPS1,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600,并通过Western blotting检测验证了该多克隆抗体的特异性,为研究Nb TPS1的生物学功能以及家蚕微孢子虫的间接免疫检测奠定了实验基础。 相似文献
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家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析 总被引：2，自引：1，他引：1
设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。 相似文献
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家蚕微孢子虫全基因组分析支持微孢子虫与真菌的亲缘关系 总被引：1，自引：1，他引：0
微孢子虫(microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,虽然分子生物学的研究证据表明其与真菌(fun-gi)存在亲缘关系,但这些证据均是基于单个或少数几个基因构建系统进化树而得出的。利用家蚕微孢子虫全基因组数据,采用基于基因同源性的Darkhorse基因组统计方法,鉴定家蚕微孢子虫基因组中每个基因的来源谱系,并通过全基因组谱系可能性指数(lineage probability index,LPI)分析微孢子虫与其他物种的亲缘关系。结果表明家蚕微孢子虫与其他微孢子虫的LPI加权平均值为0.93,具有最近的亲缘关系,与真菌界的LPI加权平均值为0.65,与原生生物界的LPI加权平均值为0.38。由此证明微孢子虫与真菌存在着更近的亲缘关系,微孢子虫门属于真菌界而非原生生物界。 相似文献
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糖蛋白在免疫识别、信号转导等生命进程中扮演重要角色。为研究微孢子虫糖蛋白及其糖基化类型,采用比较基因组学方法对微孢子虫O-甘露糖糖基化通路进行分析。真核生物的O-甘露糖糖基化通路中有6种主要酶类,包括己糖激酶、磷酸甘露糖酶、GDP甘露糖磷酸化酶、Dol-P甘露糖合成酶、甘露糖转移酶、Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶。通过生物信息学方法分析家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、比氏肠道微孢子虫(Encephalitozoon bieneusi)和柞蚕微孢子虫(Nosema antheraea)的这6种酶基因编码氨基酸序列特征及结构域类型,发现这些酶的垂直同源基因比较保守,多重序列比对表明在6种微孢子虫之间,6种酶的氨基酸序列相似性比较高,系统进化分析显示同属的微孢子虫多聚为一簇。研究结果表明,N.bombycis、N.ceranae、E.cuniculi、E.intestinalis和N.antheraea 5种微孢子虫的O-甘露糖糖基化的蛋白质修饰通路是完整、保守的,然而在E.bieneusi中,其关键酶Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶的氨基酸序列比较短,只有342个氨基酸,缺失了关键结构域PMT,因此可能无法完成O-甘露糖糖基化修饰。以上微孢子虫的O-甘露糖糖基化通路中6种主要酶的序列信息,为后续解析家蚕微孢子虫糖基化通路及对糖蛋白糖基化类型与功能的研究提供了线索。 相似文献
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己糖激酶(hexokinase,HXK)是糖酵解途径的限速酶,在能量代谢中充当极其重要的角色。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)具有完整的糖酵解途径,其基因组中有2个序列相似度较高的己糖激酶编码基因拷贝(NBO_1320g0001,NBO_27g0008)。根据其中的一个基因拷贝(NBO_27g0008)序列设计特异性引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板成功克隆了该基因,命名为Nb HXK-1。该基因大小为894 bp,包含完整的ORF,编码297个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为34.241 k D,等电点(p I)为5.26,蛋白质的氨基酸序列有31个磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点,无跨膜结构域,有信号肽,二级结构主要由α螺旋(54.55%)、延伸片段(17.80%)和无规则卷曲(27.61%)组成。系统进化分析显示Nb HXK-1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)己糖激酶(Nc HXK)氨基酸序列的亲缘关系较近。将Nb HXK-1基因插入原核表达载体p ET-28a(+)并转化BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达后经蛋白质串联质谱鉴定和Western blot分析显示,获得了与预期大小一致的约35 k D的重组Nb HXK-1蛋白,为进一步阐明Nb HXK-1的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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微孢子虫(microsporidia)长期专性细胞内寄生,其基因组表现出显著的减缩性。利用家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)基因组数据库探究在其显著减缩的基因组中是否有编码序列发挥调控序列的作用,结果发现在DNA转录调控中发挥重要作用的细胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein)的N端编码序列具有典型的真核生物启动子序列特征。设计引物扩增该基因N端590 bp包含启动子基序的序列(C启动子序列),将该启动子序列克隆到载体启动子(MET25-P)被终止序列(CYC1-T)替代的pUG35载体上,构建由该启动子序列启动下游绿色荧光蛋白(GFP)表达的克隆载体ΔpUG35-CYC1-T-C-yEGFP-CYC1-T,并将其电击转化酿酒酵母CEN.PK2菌株,经筛选及诱导培养后,在荧光显微镜下观察到酵母中有GFP表达,证实了家蚕微孢子虫细胞分裂周期蛋白的N端编码序列包含具有启动子活性的序列,表明家蚕微孢子虫基因组减缩后,部分编码序列可能扮演了调控序列的角色。研究结果也为微孢子虫启动子的活性验证提供了一个简便的途径。 相似文献
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6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)是戊糖磷酸途径的限速酶,参与生物体内递氢体NADPH的产生。通过检索微孢子虫数据库获得家蚕微孢子虫6PGDH基因序列,以家蚕微孢子虫镇江株基因组为模板,设计特异性引物成功克隆了该基因,命名为Nb6PGDH,并对该基因进行序列特征和表达特征分析,为了解6PGDH基因在微孢子虫生长发育过程中的功能提供有用信息。克隆得到的序列全长1 374 bp,包含一个完整的ORF,编码457个氨基酸;与Gen Bank数据库中家蚕微孢子虫6PGDH基因长度相同,相似度为99. 42%,其中8个碱基存在差异,编码的3个氨基酸发生改变。生物信息学分析表明Nb6PGDH蛋白没有信号肽,无跨膜结构域,分子质量为51. 8 k D,等电点5. 83,存在38个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR分析结果表明,家蚕微孢子虫感染家蚕后2~168 h,中肠组织中Nb6PGDH基因都有所表达,且表达水平在生长发育过程中发生变化,说明Nb6PGDH基因在家蚕微孢子虫增殖发育过程中具有一定的生理功能。 相似文献
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重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析 总被引：1，自引：1，他引：0
用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。 相似文献
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水通道蛋白(aquaporin,AQP)是在动物、植物、微生物细胞膜上发现的能够高选择性透过水分的一类通道蛋白。通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的AQP基因,并分析其表达特征,为研究AQP在Nb孢子侵染宿主细胞时调节孢子内渗透压的作用积累基础信息。依据从Microsporidia DB和MIPModDB数据库比对获得的序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了NbAQP基因,该基因大小为750 bp,编码蛋白质分子质量为26.66 k D,具有MIP超家族水通道蛋白的保守跨膜结构域。用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法,在Nb孢子感染宿主家蚕的7 d内,家蚕中肠组织中都能检测到NbAQP基因的表达,自感染后2 d开始,NbAQP基因的表达水平开始明显上升,直至感染后7 d达到最高水平。NbAQP基因的高水平表达时相与家蚕添食Nb孢子后中肠组织中成熟Nb孢子大量出现的时间相一致,初步推测NbAQP可能在家蚕微孢子虫成熟孢子发芽时的孢子内渗透压调节中起到重要作用。 相似文献
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以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上 相似文献
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几丁质是构成家蚕微孢子虫细胞壁的主要成分,广泛分布于原生生物、真菌、节肢动物和甲壳类生物之中,能够被几丁质酶(EC 3.2.1.14)水解。本文基于家蚕微孢子全基因组数据,采用生物信息学方法,鉴定获得家蚕微孢子虫几丁质酶基因,命名为Nb_chi。该基因有2个拷贝,其中一个Nb_chi_1长度为2 286bp,编码761aa,pI为6.35。含有一个信号肽以及一个Glyco_hydro_19结构域。另一个拷贝Nb_chi_2仅含552bp,183aa,仅含Glyco_hydro_19结构域部分,可能为一不完整的拷贝。系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与其他种类的微孢子虫聚在同一个进化枝,均属几丁质酶第19族。本文为深入进行家蚕微孢子虫几丁质酶的功能研究奠定了基础。 相似文献
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家蚕微孢子虫保存株DNA的特异性扩增 总被引：1，自引：0，他引：1
尝试研制成了一种微孢子虫检测的新系统。以家要微孢子虫小亚单位rRNA基因的推导假基因及保守序列为引物,对家蚕微孢子虫(Nosemabombycis.Nb)保存株的DNA进行了特异的PCR扩增。检测了六株微孢子虫:三株为家蚕微孢子虫株系,即保存株SES—NU、NIS—001和分离自草地贪夜蛾(Spodoptera depravata)的株系Sd—NU—IW8401;及三个种:Nosema Sp.株NIS—Mll,变形孢子虫属的分离株Vainmorpha Sp.NIS—M12和具褶孢子虫属分离株Pleistoophora Sp.PI—NU,以此六株微孢子虫的DNA为模板进行PCR扩增,仅家蚕微孢子虫(Nb)的保存株SES—NU、NIS—001获得扩增产物。 相似文献
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昆虫的C-型凝集素参与先天免疫系统中细胞间的相互作用,家蚕C-型凝集素11(C-type lectins,CTL11)基因BmCTL11是经家蚕微孢子虫(Nb)感染诱导后在蚕体内持续高量表达的基因。用生物信息学方法分析BmCTL11基因编码有307个氨基酸的多肽,预测分子质量34.51 kD,等电点4.69,含2个串联的典型C-型凝集素糖识别结构域,与烟草天蛾的IML-1蛋白进化距离最近。RT-PCR检测BmCTL11基因在家蚕幼虫时期的转录水平较高,并在多个组织有转录。将灭活的家蚕病原细菌、真菌、微孢子虫、病毒等注射家蚕5龄幼虫后的24 h内,qRT-PCR检测BmCTL11基因在幼虫脂肪体和中肠组织内的转录水平均发生上调,说明该基因能够被多种病原微生物诱导。以家蚕5龄第3天幼虫脂肪体c DNA为模板克隆了BmCTL11基因,连接到p ET-32a载体,诱导表达后将纯化的融合蛋白免疫昆明鼠制备出效价为1∶102 400的BmCTL11多克隆抗体。Western blot分析结果显示,BmCTL11蛋白可能以二聚体形式主要分布于家蚕脂肪体、血浆、中肠、表皮等组织中,推测BmCTL11在家蚕识别病原微生物并介导引发进一步的先天免疫反应过程中有重要的作用。 相似文献
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海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4),除了Nb Tre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区。基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了Nb Tre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 k D,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点。通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得Nb Tre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合Nb Tre1蛋白,其分子质量与预期值一致。融合Nb Tre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600。通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。 相似文献
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从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶(Pieris rapae)、桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的体内收集到5株对家蚕有一定食下感染力的微孢子虫,通过生物学性状、分子系统发育研究,为其分类鉴定提供依据。来自野外昆虫的5株微孢子虫均具有Nosema属的生物学特性:显微镜下观察形状均呈长卵圆形,与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)有较明显差异;在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,最后形成双核成熟孢子;与Nb抗血清均产生阳性凝聚反应;超微结构观察均具双核,极丝圈数在12～14圈之间,极丝倾斜角与Nb有差异。根据5株野外昆虫微孢子虫与其它昆虫微孢子虫基于SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及基于SSU rRNA和rRNA ITS基因序列进行的相似性和遗传距离分析,初步认为5株野外昆虫微孢子虫与家蚕微孢子虫同属异种。 相似文献