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为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。 相似文献
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抗PRRSVGP5和M蛋白独特型抗体替代抗原诱导机体产生中和抗体的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗独特型抗体(Ab2),探讨Ab2替代抗原对机体免疫调节作用的研究。用纯化的PRRSV-GP5(GP5-Ab1)蛋白和抗PRRSV-M(M-Ab1)蛋白单抗免疫大白兔,当免疫血清琼扩效价达1:16以上,加强免疫后心脏采血分离血清,分别纯化兔抗PRRSV-GP5IgG(GP5-Ab2)和抗PRRSV-MIgG(M-Ab2)血清,分别用GP5-Ab2、M-Ab2以及GP5-Ab2与M-Ab2混合型三种分别免疫未免PRRS疫苗的小猪,同时设PRRS弱毒苗、灭活苗和空白组作对照,免疫后21d采集猪血清,间接ELISA检测免疫Ab2和PRRS疫苗的猪血清全为阳性,空白组仍然为阴性。经细胞中和试验证明免疫Ab2及PRRS疫苗的猪血清都具有中和抗体,说明Ab2在体内具有替代PRRSV的作用诱导机体产生具有中和效应的中和抗体,从而起到保护机体免受PRRSV的感染作用,为猪繁殖与呼吸综合征病新型疫苗的研究提供了新的思路。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(5):799-803
应用表达纯化的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)N蛋白制备的多克隆抗体,建立了检测PPRV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对吉林省和内蒙古地区羊群感染PPRV进行了调查。方阵法确定了抗PPRV兔源IgG作为捕获抗体的包被量为0.2μg,酶标抗体的最佳稀释度为1∶1 000。对大量小反刍兽疫阴性粪便样品进行检测及统计学处理,确定了双抗体夹心ELISA检测PPRV的判定标准,即被检粪便样品D490≥0.221,判定为阳性。特异性、敏感性等试验结果表明,建立的检测PPRV抗原方法具有特异、敏感和快速等优点。与RT-PCR方法相比,该方法省时省力、简单快速。应用建立的检测PPRV抗原的双抗体夹心ELISA对吉林省和内蒙古不同地区的羊粪样进行检测,发现羊群均存在程度不同的PPRV隐性感染。本研究在国内首次揭示出临床健康羊群携带PPRV,为今后小反刍兽疫的诊断与防控提供了新的流行病学理论依据。 相似文献
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为掌握目前市售小反刍兽疫-山羊痘二联活疫苗（Clone9株+AV41株）的免疫效果及抗体消长规律，分别选择云南玉溪市和楚雄市两地的健康羊群，皮内注射小反刍兽疫-山羊痘二联活疫苗，采集免疫后不同时间段的血清样品进行抗体检测，对疫苗的安全性和免疫效果进行评价。结果显示：除个别羊只体温略有升高、采食量略有下降外，其他羊只均未出现免疫应激反应和死亡的情况；用该疫苗免疫试验羊群，小反刍兽疫抗体阳性率高，建立了理想的免疫效果屏障，而羊痘抗体阳性率很低，不具有群体免疫保护作用或保护力低下。 相似文献
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《中国草食动物科学》2020,(1)
为明确使用原核表达载体pET-32a表达纯化的小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)的最佳保存期,检测其相关抗原性与特异性,通过优化N抗原序列的密码子和蛋白表达纯化条件,在大肠杆菌表达系统中成功获得了3批次高效表达的小反刍兽疫病毒可溶性重组N蛋白。将3批次小反刍兽疫病毒N蛋白放置2～8℃保存,分别于1、2、3、6、9、12、15个月检验蛋白性状、蛋白浓度、纯度、抗原性和特异性等指标。经分析,各个时期蛋白的抗原浓度、抗原性、特异性等要素均符合标准,N蛋白保存15个月后,依然具有较强的检测抗原性与特异性。该研究结果为今后以小反刍兽疫N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法奠定了坚实的基础。 相似文献
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采用阻断ELISA抗体试剂盒检测陕北白绒山羊体内小反刍兽疫免疫抗体,探索母源抗体消长规律,比较3种常用血清学诊断方法的准确性,评价不同免疫方法对免疫效果的影响,测定小反刍兽疫活疫苗在榆林地区临床应用的安全状况、免疫效果、免疫抗体持续期。结果显示,疫苗临床使用安全,72日龄后羔羊母源抗体的平均阻断率降低,阳性率较低,适合首免,胶体金诊断试剂盒与阻断ELISA结果阳性率差异显著,按照说明书剂量皮下1倍剂量、2倍剂量或肌肉注射接种未发现任何不良反应,免疫接种14d后均能产生较高水平抗体,免疫期至少可达67周。研究结果可为合理制定陕北白绒山羊制定合理的小反刍兽疫免疫程序提供了理论依据。 相似文献
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WANG Leming WANG Yurui ZENG Zixuan RAO Guoshun WU Zhengjiao JIN Weikun WANG Dongying 《中国畜牧兽医》2022,49(2):677-686
【Objective】 This study was intend to obtain cathepsin L1(rFgCat L1) specific monoclonal antibody and construct the double antibody sandwich ELISA.【Method】 Five BALB/c mice were immunized with 1 mg/mL rFgCat L1 protein for four times.Mouse splenocytes were isolated and fused with SP2/0 cells to construct hybridoma cells.Strong positive hybridoma cell lines were screened, 1×106 cells were injected intraperitoneally per mouse to prepare monoclonal antibodies.Antibody titer and antigenic epitope were detected using ELISA method, antibody subtype and specificity were identified using Western blotting method.The double antibody sandwich ELISA was constructed by combining the anti-rFgCat L1 polyclonal antibody, and its sensitivity and specificity were tested.The positive and negative critical value was screened by 20 negative sera with positive control, and the constructed double antibody sandwich ELISA was verified by 47 goat positive sera and 47 dairy cow positive sera.【Result】 After immunization, the antibody titers in serum of 4 mice were all more than 104.After isolated mouse with the highest immune response spleen cells were fused with SP2/0 cells total of 8 of them were positive cell lines were obtained after selective culture.5D5 and 7G6 were identified as strong positive strains with stable antibody secretion.After multiple subcloning screens and subcultures, the antibodies secreted in the cell supernatant were stable, with titers of 29 and 210 respectively, with ascites titers of 107 and 108.Western blotting and antibody subtype identification kits identified that the two antibodies were IgG1 type and the light chain was kappa type, both of which could specifically bind FgESP.According to the same antigen site was recognized by the two kinds of antibodies, the antigen titer of the two monoclonal antibodies were comparied, 7G6 was used as the coating antibody, and anti-rFgCat L1 was used as the enzyme-labeled secondary antibody.The optimized condition of method was that 7G6 was coated at a concentration of 2 μg/mL, the dilution concentration of anti-rFgCat L1 polyclonal antibody was 25 μg/mL, the dilution of Don-HRP-conjugated was 1∶4 000, 5% skimmed milk powder was selected as the blocking solution and the color development time was 25 min.The method was proved that could recognize the lowest antigen concentration of 0.625 μg/mL, also could specifically recognize antigen of Fasciola fasciatus.The constructed sandwich ELISA method was used for antigen detection of 47 dairy cow positive serum and 47 goat positive serum infective samples kept in the laboratory and the positive antigen rate were 72.3% and 78.7%, respectively.【Conclusion】 Anti-rFgCat L1 monoclonal antibody was successfully prepared and the double-sheet sandwich ELISA method for fascioliasis was constructed, which provided a good theoretical basis and material basis for the development of low-cost and rapid diagnostic kits. 相似文献
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制备配对胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)单抗,建立人血清中胃蛋白酶原Ⅱ夹心ELISA检测方法。用胃蛋白酶原Ⅱ免疫Balb/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0融合,用HAT培养基进行筛选培养,间接ELISA检测阳性克隆,对阳性孔进行多次单克隆化,选出效价高、分泌性能稳定的杂交瘤细胞,制备腹水并进行纯化。进行单抗配对,建立胃蛋白酶原Ⅱ双抗体夹心检测方法。获得1D8、1C6、2H11、2E3等4株杂交瘤,经配对试验,确定1D8、2H11可作为夹心ELISA检测PGⅡ的单抗。成功制备出配对单抗,初步建立了PGⅡ双抗体夹心ELISA方法。 相似文献
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为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。 相似文献
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试验旨在利用胶体金免疫层析技术建立快速检测犬血清中犬细小病毒（canine parvo virus, CPV）血凝抑制（haemagglutination inhibition, HI）抗体效价的方法,用于CPV疫苗免疫效果评价。采用双抗体夹心法,以抗CPV血凝相关抗原的单克隆抗体制备CPV抗原检测试纸条;将犬血清进行不同比例系列稀释后,分别与定量CPV抗原充分反应,滴入CPV胶体金试纸条,根据试纸条检测线（test line,T线）消失时的血清最高稀释倍数判断血清中CPV抗体的HI效价;用此方法检测86份犬血清样品,并与传统血凝抑制试验方法进行分析比较。结果显示,成功制备CPV抗原检测试纸条,确定了试纸条检测犬血清CPV-HI效价的反应条件和结果判定标准。结果表明,在检测不同稀释倍数犬血清反应后的CPV抗原时,能使试纸条T线消失时的血清最高稀释倍数与HI效价具有正相关性,犬血清最高稀释倍数乘以4即为HI效价;两种方法的符合率达90.7%。本试验初步建立了胶体金试纸条检测CPV血凝抑制效价的方法,为检测CPV-HI效价提供了一种操作简单、快速的试验方法,可用于CPV疫苗免疫效果评价。 相似文献
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MA Yong-ying SUN Ming SHEN TU Fen-qin KONG Han-jin YANG Xin-yan QIN Ya-man CHEN Xi-zhao JIA Hong 《中国畜牧兽医》2016,43(8):1983-1988
The study was aimed to use colloidal gold immune chromatography technology to establish a rapid method for detection of canine serum canine parvovirus (CPV) hemagglutination inhibition (HI) titer and CPV vaccine immunization effect assessment.Double antibody sandwich method and monoclonal antibodies of anti-CPV hemagglutination antigen were used to prepare CPV antigen test strip.Canine serum with different proportion respectively was mixed with quantitative CPV antigen for full reaction,then dropped the mixture into the CPV colloidal gold test strip,so according to the highest serum dilution ratios when the test strip line T (line T) vanishes,it was to judge CPV antibodies in serum of the HI titer.This method had been used to detect 86 canine serum samples,at the same time,analyzing and comparing it with traditional hemagglutination inhibition test method.The results showed that the CPV antigen detection test strip was successfully prepared,and the reaction conditions and results of the test strip for detecting the titer of CPV-HI in canine serum were determined.The results indicated that when detecting CPV antigen after the dilution of different ratios of canine serum,the highest serum dilution ratios when the strip line T vanished and the HI titer had positive correlation.The highest dilution ratios of canine serum multiplied by 4 was the HI titer.The results of two methods had 90.7% consistency.This experiment established the colloidal gold immune chromatography test strip for the detection of CPV-HI titers method initially.This CPV-HI detection provided a simple and fast test method for the effect evaluation of CPV vaccine immune. 相似文献
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【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具... 相似文献
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本研究旨在建立一种可辅助猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离鉴定的直接荧光抗体检测方法。借助基因工程技术融合表达PEDV S1基因中和抗原表位区域（COE）,层析柱法纯化兔源免疫球蛋白IgG,搅拌法标记荧光素。通过Western blotting和动物免疫试验测定表达融合蛋白的抗原性,间接ELISA方法测定免疫后的抗体效价,直接免疫荧光法测定标记荧光抗体的特异性,梯度稀释方法测定标记抗体的最佳工作浓度。结果显示,本研究成功将423 bp的S1基因中和抗原表位COE进行融合表达,表达蛋白大小约40 ku,蛋白命名为pGEX-6P/COE;Western blotting检测结果表明,融合蛋白具有良好的反应原性;ELISA检测结果显示,免疫后35 d的血清抗体效价达1：25 600;与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪瘟病毒（CSFV）及猪细小病毒（PPV）等均无非特异性反应,标记的荧光抗体具有良好的特异性,最佳工作稀释度为1：32~1：64。综上所述,本试验制备的直接免疫荧光抗体可用于细胞平台上的PEDV快速检测,能直观地提供相关检测数据,对于病毒分离过程的取舍具有重要指导意义。 相似文献
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为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。 相似文献