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1.
[目的]构建犬细小病毒(CPV) VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT - PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8h取其肝脏提取总RNA,进行RT - PCR方法扩增.[结果]在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)- CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达. 相似文献
2.
研究采用PCR 方法从焦虫病患牛的全血基因组中扩增得到846 bp 的Tams1 基因片段,将其克隆至真核表达载pcDNA3.1(+),构建Tams1基因的真核表达质粒.经测序验证后, 将Tams1基因的真核表达质粒尾静脉注射小白鼠进行Tams1 基因的瞬时表达.取接种小鼠的肝脏提取总RNA,采用RT-PCR 扩增目的条带;用重组质粒pcDNA3.1(+)-Tams1 皮下注射免疫小白鼠4 次后,进行免疫抗体检测.试验结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1含有完整的Tmas1基因片段.用该重组质粒免疫小鼠56 d后,小鼠血清中抗重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1的抗体效价可达1∶12 000以上,说明该重组质粒具有很强的抗原性.经Western-blot检验可得到抗原-抗体复合物产生的特异性条带,说明该重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1具有免疫原性. 相似文献
3.
[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。 相似文献
4.
[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。 相似文献
5.
[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。 相似文献
6.
牛双芽巴贝斯虫新疆株HSP20基因的克隆和真核表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
通过设计牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白HSP20基因序列的特异性引物,采用 PCR方法从疑似"牛焦虫病"的患牛全血基因组中扩增得到699 bp的HSP20基因,将其连入pMD18-T测序、鉴定,再将验证的699 bp的HSP20基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核载体PCDNA3.1-HSP20.经再次测序、鉴定后,尾静脉注射小白鼠进行HSP20基因的瞬时表达,取其肝脏提取总 RNA,经RT-PCR方法扩增出一条534 bp的目的条带,表明真核表达质粒构建成功. 相似文献
7.
[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。 相似文献
8.
牛巴贝斯虫新疆株MSA-2c基因重组质粒的构建、真核表达及其免疫反应性研究 总被引：7，自引：4，他引：3
根据GenBank公布的牛巴贝斯虫裂殖子表面抗原MSA-2c基因序列设计引物,采用PCR方法从患病牛的全血基因组中扩增得到798 bp的MSA-2c基因片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达MSA-2c基因,取其肝脏提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增可得到目的条带;用重组质粒pcDNA3.1( )-MSA-2c肌肉注射免疫小白鼠4次后,将获得的抗血清作为抗体,纯化的GST-MSA-2c融合蛋白作为抗原进行Western-blot检测,可得到抗原-抗体结合产生的特异性条带,表明重组质粒具有免疫学活性. 相似文献
9.
[目的]构建含G FP-LC3B基因的真核表达载体.[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到cDNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pcDNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pcDNA3.1-GF载体上,得到cDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体.[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体cDNA3.1-GFP-LC3B.[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础. 相似文献
10.
为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。 相似文献
11.
【目的】白介素-7是动物体一种重要的多功能细胞因子,在促进B细胞、T细胞的形成和发育,在协同其它细胞因子提高机体免疫能力等方面发挥重要作用。本试验利用犬细小病毒VP2 DNA疫苗,在小鼠体内分析了犬白介素-7（cIL-7）基因的免疫增强作用。【方法】采用RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中扩增cIL-7基因,然后将cIL-7基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,分别构建成与Myc/His标签融合和非融合的cIL-7真核分泌型表达载体pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。由磷酸钙介导将pcDNA-cIL7/MH质粒转染HEK 293T细胞使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的表达载体能否介导cIL-7基因在真核细胞中进行分泌表达。用已构建的VP2表达载体pcDNA-CD5-VP2与pcDNA-cIL7载体共免疫小鼠,并设pcDNA-CD5-VP2单免疫小鼠和pcDNA-cIL7单免疫小鼠作为对照。免疫后通过ELISA方法检测抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验和ELISA方法分别检测免疫后35 d小鼠脾脏淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素的表达水平。【结果】本试验扩增的cIL-7基因序列与GenBank中犬的序列完全一致。构建的表达载体能够介导cIL-7基因在HEK293T细胞中进行分泌表达。动物免疫试验结果显示,cIL-7与VP2共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价分别极显著和显著高于VP2单免疫组（P＜0.01和P＜0.05）;共免疫组小鼠淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平也显著高于VP2单免疫组（P＜0.05）。【结论】cIL-7基因可增强小鼠对VP2 DNA疫苗的免疫应答反应。 相似文献
12.
根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增。把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定。将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,再将构建成功的原核表达质粒载体pGEX-4T-2-VP2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行鉴定、测序、表达。结果表明,克隆的VP2基因片段全长1 755 bp,与13个VP2基因序列的同源性为98.4%～99.8%。系统进化树分析表明,所克隆的VP2 CSN830611序列同日本株(AB054222)、意大利株(AF306445)的进化途径一致。Western-blotting分析显示,表达产物为90 kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性。 相似文献
13.
[目的]以期建立犬细小病毒巢式PCR诊断方法.[方法]根据基因库已发表的CPV VP2基因序列设计二对巢式引物,以临床上疑似CPV感染的犬粪样品中提取的总DNA作为模板,用巢式PCR方法扩增出CPV VP2基因的目的条带.[结果]扩增出的目的基因与国际标准序列的同源性为99.3;～ 100;.特异性试验发现该引物不能启动犬其它常见病毒基因的扩增.敏感性试验表明该引物能检测到10-9的CPV总RNA量.重复性试验显示该引物具有良好的稳定性.对采集的26份样品进行CPV巢式PCR检测,20份样品为阳性,阳性率为76.9;.[结论]建立的CPV的RT - PCR检测方法可于临床CPV的快速诊断和小规模的分子流行病学调查. 相似文献
14.
根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达. 相似文献
15.
[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。 相似文献