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【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号：KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质... 相似文献
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为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：... 相似文献
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为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×104TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。 相似文献
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本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。 相似文献
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旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。 相似文献
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研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 相似文献
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为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEFP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用Nhe Ⅰ和Age Ⅰ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr LB平板上筛选阳性克隆.重组子经Nhe Ⅰ和Age Ⅰ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选.结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础. 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(5)
为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。 相似文献
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为了构建猪神经介素B(pNMB)基因慢病毒过表达载体,以及研究其在猪睾丸间质细胞中稳定表达情况,试验采用RT-PCR方法扩增获得pNMB基因的CDS序列,插入到pMD-19T载体中,构建pMD19-T-pNMB重组质粒,对该重组质粒和慢病毒过表达质粒pCD513B-1进行双酶切,以获得的线性化pCD513B-1和线性化pNMB质粒构建pCD513B-1-pNMB重组慢病毒过表达载体;将重组慢病毒过表达载体pCD513B-1-pNMB和辅助质粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)共转染至HEK293T细胞中,包装获得pNMB过表达慢病毒,并用倍比稀释法测定病毒含量;用pNMB过表达慢病毒转染猪睾丸间质细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达的细胞,利用实时荧光定量PCR方法检测pNMB mRNA的表达情况。结果表明：RT-PCR扩增获得大小约为366 bp的目的片段,与GenBank中pNMB基因的CDS序列完全一致,RT-PCR扩增片段与目的片段序列完全相同;将pNMB基因克隆到pMD-19T载体中,成功构建出pMD19-T-pNMB重组质粒;XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒p... 相似文献
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旨在研究活化转录因子4(ATF4)基因敲除对小鼠眼睛发育的影响。将小鼠分为野生型(WT)组和ATF4敲除(KO)组,采用器官大体观察和组织病理学分析,明确ATF4基因敲除后对小鼠眼睛发育的影响。结果发现,WT小鼠眼球大小及组织结构正常。而ATF4^-/-小鼠眼球体积缩小;脉络膜和视网膜层层次结构基本存在,各个层次结构紊乱;神经节细胞层细胞数基本正常,约2层细胞,但细胞排列不整齐;内丛状层结构疏松,厚度增加;外核层细胞层次增加,超过10层,同时结构松散、形成裂隙和囊样结构;内核层细胞层次减少、约6层~8层细胞,细胞排列轻度紊乱。整个视网膜在局部形成乳头状突起;脉络膜基本正常,但没有乳头状的睫状突形成。眼球内玻璃体缺失,由水肿的纤维结缔组织构成,中央可见多个小血管。总之,ATF4^-/-小鼠展示了小眼表型,同时ATF4^-/-小鼠眼睛结构异常。 相似文献
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为探究microRNA-155(miR-155)对小鼠棕色脂肪组织分化的影响,收集广泛过表达miR-155的转基因小鼠(RL-m155小鼠)棕色脂肪组织,离体棕色脂肪大体拍照,然后收集部分组织固定、石蜡包埋和切片,并行HE染色,观察棕色脂肪细胞的大小和形态;同时RT-qPCR检测棕色脂肪组织中分化相关基因的表达水平。结果表明,RL-m155小鼠的体重、体型与对照小鼠无显著差异;与对照小鼠相比,RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155表达水平显著升高,而棕色脂肪组织体积及棕色脂肪细胞的大小均显著减小;棕色脂肪中特异表达基因(UCP1和SCA-1)、棕色脂肪分化调控因子(BMP2、BMP6、Smad1、Smad5、C/EBPB、MYO10和PTEN)、棕色脂肪分化诱导因子(PPARγ、PGC-1α、BMP2、BMP4、BMP7、BMPR1A和Sirt1)等棕色脂肪分化相关功能基因的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。表明RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155过表达,导致棕色脂肪组织分化受损。 相似文献
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通过2K1C法制作肾性高血压(RH)大鼠模型,研究向天果提取物(SME)对肾性高血压大鼠的降压和靶器官保护等治疗作用。将造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性组(25mg/kg卡托普利)、SME高剂量组(500mg/kg)、SME低剂量组(250mg/kg)。给药8周后,血液生化测定肾功能指标,并采用ELISA测定肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)活性。取右肾进行组织切片,HE染色,组织学观察。结果表明,与模型组相比,SME能显著降低RH大鼠收缩压(P<0.01)。与模型组相比,SME高、低剂量组明显降低RH大鼠RAAS水平(P<0.01)。各治疗组对RH大鼠肾脏损伤有不同程度的改善。说明向天果提取物有降压、保护肾脏的作用,其机制可能与抑制RAAS兴奋,抑制血管收缩,以及水钠重吸收有关。 相似文献
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为研究两色金鸡菊提取物对小鼠的抗疲劳和耐缺氧作用,选择48只小鼠随机分为4组,即对照组,低、中、高剂量两色金鸡菊提取物组(每日5、10、20g/kg体重)。各组小鼠分别灌胃(每日0.20mL/10g)给予不同剂量的两色金鸡菊提取物,连续灌胃21d后,观察不同浓度的两色金鸡菊提取物对小鼠负重游泳时间及运动后小鼠血清尿素氮、血乳酸、肝糖原含量和小鼠常压耐缺氧存活时间、断头后呼吸维持时间的影响。结果表明,两色金鸡菊提取物能延长小鼠负重游泳时间,降低运动小鼠血清尿素氮、血乳酸含量,增加运动小鼠肝糖原含量,明显延长小鼠常压耐缺氧存活时间及断头后呼吸维持时间。结果提示,一定剂量的两色金鸡菊提取物具有抗疲劳作用和提高耐缺氧能力作用。 相似文献
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两广小花猪(壹号黑猪)新品系是以广东小耳花猪、陆川猪两个类群为育种素材,以繁殖性能为主,结合肉质、生长发育及外貌选择,经6年4个世代选育而成的高繁殖力新品系。为分析该品系毛色选育效果及其特性与利用价值,以该品系毛色选育提纯效果及各世代种猪生产性能测定数据为基础进行研究。结果表明,以MC1R基因作为遗传标记基因,结合表型选择,可逐渐纯化新品系群体;总产仔数与产活仔数,3世代初产母猪较0世代初产母猪分别提高1.05、0.72头(P>0.05),3世代经产母猪较0世代经产母猪分别提高0.75、0.76头(P<0.05);生长性状及胴体、肉质性状,3世代未发生较大变化。结论:两广小花猪(壹号黑猪)新品系提纯效果突出,繁殖性能得到明显地改善提高,且未对生长及胴体、肉质性状产生不利影响。该品系的培育为地方猪品种内的品系培育提供参考。 相似文献
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采用CCK-8比色法检测大腹园蛛水溶性成分(WSFAV)对RAW264.7细胞的作用,并通过检测LPS刺激RAW264.7细胞后的IL-6和IL-1β的表达,证明WSFAV的体外抗炎效果。另外,利用小鼠急性腹腔炎症模型,进一步研究WSFAV的体内抑制炎症作用,并通过检测炎症细胞TLR-4的表达,初步证明WSFAV的抗炎机制。结果表明:WSFAV对细胞的活性无显著影响,但对炎症细胞表达IL-6和IL-1β具有明显抑制作用(P<0.05或0.01),并且WSFAV对小鼠急性腹腔炎症和炎症细胞的TLR-4的表达也有明显抑制作用。结果显示,WSFAV具有良好的抗炎作用,且其抗炎机制应该与TLR-4的表达相关。 相似文献
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对新选育品种进行全面而合理的评判是家蚕品种选育工作的一个重要环节。根据2015—2017年家蚕品种国家审定多点鉴定成绩的年度汇总数据,利用非参数统计法、高稳系数法以及稳定性参数法等分析方法,分别对农村生产鉴定成绩中的盒种产茧量、健蛹率与实验室鉴定成绩中的茧丝长、解舒率与洁净等反映家蚕品种高产稳产、丝质性状的关键性指标进行水平比较和稳定性分析,其结果与平均数、标准差、变异系数等常用方法的分析结果趋向相一致。家蚕品种锦·绣×潇·湘的盒种产茧量比对照品种秋丰×白玉高12.07%,表现出了产茧量高、稳产性强、丝质优的特点,具有广阔的推广应用前景。 相似文献
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本试验旨在研究饲料中添加谷胱甘肽对花鲈幼鱼生长性能、血清生化指标和抗氧化能力的影响。选用初始体重为(12.56±0.12)g的花鲈600尾,随机分为6个组,每组4个重复,每个重复25尾鱼。对照组饲喂基础饲料,试验组饲喂在基础饲料中分别添加100、300、400、500和700mg/kg谷胱甘肽的试验饲料。试验期56d。结果表明:1)各组间生长性能和常规营养成分指标无显著差异(P>0.05)。2)与对照组相比,100 mg/kg组血清葡萄糖和尿素氮含量以及700 mg/kg组血清葡萄糖含量及谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性均显著升高(P<0.05)。3)与对照组相比,500和700 mg/kg组血清总抗氧化能力、谷胱甘肽含量和谷胱甘肽过氧化物酶活性以及各试验组血清谷胱甘肽巯基转移酶活性均显著升高(P<0.05)。4)与对照组相比,300和400mg/kg组肝脏超氧化物歧化酶活性以及100、400、500和700mg/kg组肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著升高(P<0.05),100和700mg/kg组肝脏谷胱甘肽巯基转移酶活性显著降低(P<0.05)。5)与对照组相比,300mg/kg组肝脏白细胞介素-6含量显著升高(P<0.05)。由此可见,饲料中添加谷胱甘肽可提高花鲈血清和肝脏一些抗氧化指标,但对于部分抗氧化指标和肝脏炎症因子指标却呈负面影响。因此,在本试验基础饲料条件下,花鲈饲料中应当慎重添加谷胱甘肽。 相似文献
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利用正己烷、无水乙醇、乙酸乙酯和氯仿-甲醇(体积比2∶1)4种有机溶剂提取柞蚕蛹油,并对蛹油中的甘油酯、磷脂、甾醇、维生素E等脂类物质进行较为系统地分析。结果表明,柞蚕蛹油中的脂类物质主要为甘油酯,其中甘油三酯约占88%,1,3-甘油二酯(1,3-DAG)约占1%,1,2-甘油二脂(1,2-DAG)约占1.5%;脂肪酸中不饱和脂肪酸的含量高,质量分数可达到80%以上,其中α-亚麻酸占40%,油酸占29%,亚油酸占7%;脂类物质中维生素E的质量分数高达382.56μg/g,主要为α-生育酚(255.00μg/g),还含有少量β-生育酚、γ-生育酚和γ-生育三烯酚;甾醇类物质主要由胆固醇和β-谷甾醇组成,其中β-谷甾醇的质量分数达到3.36 mg/g;磷脂类物质主要由溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷酯酰丝氨酸(PS)组成,其中PE含量最高,达到34.82%,PS含量最低,仅占1.28%;采用质谱鉴定出18种甘油三酯,相对含量较高的依次为二油酸棕榈酸甘油酯(POO)、二亚麻酸棕榈酸甘油酯(PLnLn)和二亚麻酸亚油酸甘油酯(LLnLn),其含量分别占总甘油三酯的21.18%、14.22%和10.54%。 相似文献