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为进一步分析转AgGlpF基因耐盐转基因大豆E8A7027转化体的分子特征信息并对其进行特异性检测，本研究分离该转化体的旁侧序列并建立其特异性PCR检测体系。基于基因组重测序技术并结合Sanger测序技术，将基因组重测序分析获得的序列信息与参考大豆基因组进行对比，确定E8A7027转化体的T-DNA区在大豆基因组上的插入位点及其5′端和3′端的旁侧序列。根据旁侧序列设计PCR检测引物，并对检测体系的特异性、灵敏度进行实验室内验证。结果显示：转基因大豆E8A7027的整合位点为Chr09染色体的33886331位点，整合方式为单拷贝插入，受体基因组DNA在插入位点缺失了1段58 bp序列，分别获得E8A7027大豆的5′端旁侧序列910 bp和3′端旁侧序列802 bp。根据这两个旁侧序列设计引物建立的PCR检测方法，能够特异性地将E8A7027大豆转化体与其他转基因作物和非转基因大豆区分开，方法的检测灵敏度为0.05%。研究结果可为E8A7027转化体的安全评价和监管检测提供技术支撑。 相似文献
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转基因油菜RF1的外源基因插入位点分析与事件特异性检测方法研究 总被引：5，自引：1，他引：4
采用基因组步移和巢式PCR方法研究了转基因油菜雄性不育恢复系RF1外源基因插入位点序列特征,并根据此特征建立了RF1转化事件特异性检测方法。从RF1基因组DNA中分离到外源基因插入位点的左边界旁侧序列798bp,包括335bp的插入载体序列和463bp的旁侧基因组序列。根据已发表的RF1右边界旁侧序列的信息,发现外源T-DNA在向油菜基因组整合的过程中,在整合位点处有75bp的基因组序列丢失。根据分离的RF1左边界旁侧序列,建立了RF1事件特异性定性检测方法,扩增片断大小为284bp。利用建立起来的RF1事件特异性定性检测方法可以准确的将转基因油菜RF1与其它的转基因油菜品种区分开,检测灵敏度达到5个拷贝（0.013%）。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因油菜品种RF1的身份识别提供了有效的方法。 相似文献
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为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。 相似文献
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采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。 相似文献
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转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。 相似文献
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为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
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为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
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由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease, PBD）是甘蔗的主要病害之一。在广西,甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）是PBD的优势病原菌。尽管PBD的研究已有较长的历史,但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理,本研究采用农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）技术构建甘蔗镰孢菌FF001菌株的T-DNA插入突变体库。采用携带潮霉素B磷酸转移酶基因pTHR1-AH双元载体的农杆菌菌株AGL-1介导转化F. sacchari分生孢子,获得3018个转化子;随机选取12个转化子进行PCR检测和Southern杂交分析,结果显示所有检测突变株均插入潮霉素B磷酸转移酶基因,多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力,获得致病力明显减弱21个和致病力增强9个,共30个突变体。通过TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对,确定了其中27个突变株的T-DNA插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失,导致1... 相似文献
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HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。 相似文献
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大豆通常被认为是较难转化的豆科作物之一,大豆基因型是影响大豆转化效率的重要因素。采用农杆菌介导大豆子叶节遗传转化方法,对2个国外大豆品种和9个国内品种进行转化研究,对转化再生植株进行BAR试纸条和PCR检测。结果表明:不同大豆品种再生率及转化效率存在显著差异。国外品种Jack和Bert,南方大豆品种华春6号和东北大豆品种沈农9号具有较高的再生率和转化效率,转化效率分别达到6.45%、3.80%、3.24%和2.86%。对来源于沈农9号的PCR阳性植株进行Southern杂交检测,结果表明:外源基因已导入受体大豆品种,该受体品种实际转化效率为2.14%。对外源T-DNA插入结构进一步分析表明:低拷贝(1~2个)T-DNA插入比例为75%。本研究筛选了4个转化效率较高的大豆品种,为开展高效大豆遗传转化研究提供依据;同时,作为大豆主栽品种,利用华春6号和沈农9号作为受体品种开展转基因研究,对于加快转基因大豆新品种培育研究也具有重要的参考价值。 相似文献
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为了验证大豆子房滴注转化方法的可重复性与遗传稳定性,将由报告基因GUS、表达调控序列(35S肩动子,NOS终止子)和T-DNA边界序列3部分组成的基因表达框转入大豆.对T0代转化材料进行GUS组织化学染色分析和PCR检测.结果表明:在检测的340个幼胚中有12个呈GUS阳性,且在180个转化植株中有6个呈PCR阳性同时其叶片也呈GUS阳性,转化率分别为3.53%和3.33%.Smthern杂交表明外源GUS基因表达框以低拷贝的形式整合到大豆基因组中对转基因后代叶片GUS染色、PCR分析及Northern blot检测结果表明外源基因已遗传给了后代,其中S2株系符合盂德尔分离规律. 相似文献
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稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选 总被引：5，自引：0，他引：5
利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。 相似文献
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《中国油料作物学报》2016,(2)
为全面揭示大豆优良品种和重要亲本的全基因组突变类型,采用高通量重测序技术,对大豆品种齐黄34进行全基因组重测序,测序深度13×,共检测到1 519 494个单核苷酸多态位点,357 549个小片段插入缺失位点,4 506个结构变异;这些变异共导致了17 748基因变异;大量光周期相关的重要基因发生突变,其中包括CRYPTOCHROME 2、GIGANTEA、Timing of CAB expression 1、E1、PHYTOCHROME A、Flowering Locus T、CONSTANS、Terminal Flower like等,齐黄34为E1基因型。本研究为分子标记辅助选择提供了重要的标记资源。 相似文献
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利用电穿孔转化法,把携带人乳铁蛋白基因(hlf)的银耳表达载体pCB-hlf导入银耳芽孢菌株Tr21,用PCR鉴定该基因阳性转化子,检测转基因菌株的GUS活性,并用Southern杂交检测hlf的插入位点。结果表明:电穿孔转化法的转化率可达到9.25×106个/μg质粒DNA;抗性筛选的阳性转基因菌株中均能扩增出与预期大小相符的hlf、GUS和Tnos序列,且GUS基因在转基因菌株中均有表达。Southern杂交结果表明,不同转基因菌株hlf的插入位点不同,有些菌株插入了2个或更多的拷贝。RT-PCR结果表明,外源基因在银耳中能正常转录成RNA。 相似文献
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转基因大豆是目前我国进口量最大的转基因作物,为避免转基因大豆及制品的违法使用,快速筛查大豆中转基因成分的方法策略亟待开发。为检索已知商业化转基因大豆的外源基因信息,通过构建转基因大豆常用转化元件的数据库,建立了转基因大豆的筛查策略。结果表明:已知的15个转基因大豆转化事件中,利用Ca MV35S启动子、CP4-epsps基因、Bt基因、pat基因4个靶标元件的组合,可筛查12个转基因大豆的转化事件;另有3个转化事件需要使用转化事件特异性引物检测。使用4个靶标元件和转化事件组合的筛查方法检测的灵敏度可达到1 g·kg~(-1),可对大豆中的转化事件进行快速、高灵敏度的筛查。 相似文献
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利用经PCR、GUS染色和Southern杂交均证明已成功转入Hb CBF1的、田间表型为矮化的橡胶树植株C1为材料,通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA右侧侧翼序列1.6 kb,根据侧翼序列与载体的序列设计引物分析验证该序列真实可靠,并设计引物判断基因的T-DNA插入以杂合位点存在,与此同时,将该侧翼序列与已有的橡胶树基因组测序结果进行比对分析,发现该插入位点处并不存在基因,根据CBF1与Ca MV35s启动子的研究推测,C1植株的矮化表型是由于Ca MV35s启动子驱动抗逆基因导致,而非插入基因造成。 相似文献
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大豆翻译延伸因子GmEF1A干扰载体的构建及大豆遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
研究发现GmeEF1A与大豆花叶病毒的P3蛋白存在互作关系,并且参与SMV在大豆体内的繁殖。通过大豆GmeEF1A基因5个拷贝的核苷酸和氨基酸序列比对,确定其保守区间,克隆得到180 bp的干扰片段GmeEF1Ai。利用GATEWAY技术构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)表达载体pB7GWIWG2(II)-e EF1Ai,并通过农杆菌介导的子叶节转化法导入到受体大豆品种天隆1号中。测序结果显示重组质粒中插入的干扰片段GmeEF1Ai与目标序列完全符合,通过PCR和酶切验证表明GmeEF1Ai是以反向重复形式插入到表达载体中。经转化获得组培苗8株,PCR、除草剂涂抹和PAT/bar试纸条多重检测确认7株为阳性。绝对荧光定量结果显示,阳性苗中4株为单拷贝。GmeEF1A基因表达量分析结果显示GmeEF1Ai载体对GmeEF1A的5个拷贝基因有不同程度的阻抑。这不仅为验证GmeEF1A基因在大豆受SMV侵染时的功能提供试验材料,也为大豆抗病育种提供新的种质。 相似文献
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胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析 总被引：2，自引：2，他引：0
利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入. 相似文献
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双T-DNA表达载体转化大豆的研究 总被引：5，自引：1，他引：4
利用含有筛选标记基因和目的基因△6-脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA共转化表达载体pLIN61,经农杆菌EHA101介导,采用子叶节转化法转化大豆,使用除草剂Glufosinate作为筛选剂,获得了一批携带有玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆,转化效率为2.0%,共转化频率及实际转化率分别为56.25%、1.12%.PCR检测和Southern杂交结果证明,玻璃苣D6D已经整合到大豆的基因组上.RT-PCR检测结果显示,玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因大豆的转录水平上得到了表达. 相似文献