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为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法，本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针，通过优化PCR反应体系和反应条件，建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法，验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示：本研究所建立的检测方法特异性强，与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应；灵敏度高，能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好，组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑，为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。 相似文献
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为了建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)快速、敏感的检测方法,根据GenBank中登录的中国流行株ASFV-SY18的P72基因,建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对所建立方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,所建立的非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法能有效扩增1.0～1.0×10~9 copies·μL~(-1)的ASFV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0 copies·μL~(-1);对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数小于1%,重复性良好。 相似文献
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【目的】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的方法,为非洲猪瘟（African swine fever, ASF）的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持。【方法】首先,以ASFV中国流行毒株（GenBank: MK333180.1）的MGF360-13L基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针,建立其荧光定量PCR检测方法。设计引物13L-F/13L-R,扩增MGF360-13L,并将其克隆至pOK12载体,挑取阳性克隆并测序验证,构建重组质粒标准品。将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释,以稀释后的各梯度质粒标准品为模板,配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对其敏感性和重复性进行评价;其次,以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板,利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测,以比较荧光定量PCR的敏感性。最后,运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFV p72的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测,以比较两种检测方法的符合率。另外,应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测。【结果】利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800 bp左右的特异性目的条带,而阴性对照无条带,成功构建出标准品。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.56×101-1.56×108拷贝/μL时,呈现出良好的线性关系,线性回归方程为：y =-3.295 lg(x) + 45.995,线性相关系数R2为0.997,对ASFV核酸最低检测限为15.6拷贝/μL。在特异性检验中,除ASFV核酸外,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型等病毒核酸均未出现扩增曲线,表明该方法的特异性良好。与最低检测限为1.56×104拷贝/μL病毒核酸的常规PCR检测方法相比,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法高出其约3个数量级,具有较高的敏感性。在临床样品检测中,两种检测方法经过McNemar检验,P = 0.5>0.05,表明两种检测方法的结果无统计学差异;经过Kappa检验,Kappa = 0.867>0.75,P<0.001,提示两种检测方法符合率较好,能够有效区分ASFV野毒株和MGF360-13L基因缺失毒株。【结论】建立的TaqMan荧光定量PCR特异、敏感、重复性好,不仅丰富了ASFV现有检测靶标,也为后续MGF360-13L功能、MGF缺失毒株的鉴定及相应基因缺失疫苗株的鉴别诊断提供技术支持。 相似文献
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非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Viruses,ASFV)引起的猪高发病率和死亡率的急性烈性传染病,各年龄段的猪只均可感染发病。由于ASFV本身的复杂性及对毒力因子和相关保护基因的了解不足,暂无有效疫苗和针对性药物。自2018年8月我国首次报道非洲猪瘟疫情以来,ASF给我国养猪业绿色健康发展带来巨大威胁。对ASF的成功防控很大程度上依赖于快速可靠的实验室诊断、猪群疫情的隔离扑杀和严格的生物安全措施。从分子生物学和免疫学检测两方面综述了当前非洲猪瘟检测技术的研究进展,其中分子生物学方法包括普通PCR、荧光定量PCR、数字PCR、等温扩增技术等,免疫学检测方法包括红细胞吸附反应、ELISA、免疫层析试纸条法、免疫印迹等,以期为不同条件下非洲猪瘟诊断提供选择参考。 相似文献
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非洲猪瘟在临床上出现多种毒株,主要分为野毒株和基因变异毒株。因其在临床上造成不同程度的危害,有必要建立一种方法进行正确诊断和健康监测。为实现野毒株和基因变异毒株的鉴别诊断,研究根据GenBank中的ASFV中国流行株(登录号：MK333180.1)的P72、CD2v、MGF基因保守序列设计引物,建立一种可以同时检测上述三种基因的三重荧光定量PCR方法。三重荧光定量PCR方法对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒2型(PRV)和猪圆环病毒(PCV2)检测均无交叉反应,表现出较强的特异性。敏感性检测显示针对P72、CD2v和MGF重组质粒标准品的最低检测下限为103～102 copies/mL。在重复性试验中,大部分组间变异系数均小于2%或接近2%,具有较好的重复性。试验表明,三重荧光定量PCR方法可用来鉴别野毒株和基因变异毒株。 相似文献
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为了研制灵敏、准确、特异及稳定的非洲猪瘟抗体快速检测试纸产品,以非洲猪瘟病毒（ASFV）p72蛋白为检测抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）为拦截线,对比重组蛋白p72的不同状态对试纸检测性能影响,优化标记条件、喷膜浓度、样品垫缓冲体系及成分、显色时间等因素,确定ASFV抗体检测试纸产品化的具体参数,并对试纸的特异性、均一性、准确性及稳定性进行鉴定。结果显示,试纸的检测敏感性为1∶51 200,优于商业化ASFV检测试剂盒,与其他猪源病毒阳性血清无交叉反应,变异系数小于10%,在临床样本检测中未见假阴性及假阳性结果,具有良好的敏感性、特异性、均一性及准确性;经加速稳定试验验证,可以室温保存1 a以上;与进口商品化试剂盒的总符合率为91.6%。综上,成功研制了ASFV抗体检测试纸,且试纸的检测性能良好,可以用于ASFV抗体的快速筛查。 相似文献
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【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)快速检测方法，为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种基因型66个毒株的E165R基因多序列比对，选取相对保守区域设计LAMP引物，并对反应条件及反应体系进行优化。在获得的最优反应条件及体系下考察方法的检测特异性和灵敏性。【结果】选取的LAMP检测靶标235 bp(29～264 bp)在不同基因型ASFV毒株中保守性较好，序列相似度达94.46%～100%;LAMP反应的最佳温度为64℃、时间为35 min、Mg2+浓度为8 mmol/L、内外引物比为8︰1、Bst DNA聚合酶量为16 U。建立的ASFV环介导等温扩增检测方法最低检测限为50 copies/μL,较常规PCR检测提高1个数量级，且35 min即可完成扩增反应。LAMP检测方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PR... 相似文献
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非洲猪瘟病毒感染猪后可引起猪高热、皮肤和内脏器官出血和高死亡率,死亡率可达100%。自2018年8月非洲猪瘟在中国首次报道以来,迅速席卷全国,给猪业造成严重的经济损失。文章综述6种非洲猪瘟病毒分子生物学检测方法,主要包括核酸探针、纳米PCR、荧光定量PCR、微滴数字PCR、环介导等温扩增技术、重组聚合酶扩增技术等。 相似文献
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猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。 相似文献
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【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。 相似文献
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为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签p35蛋白,以此为包被抗原,通过一系列的条件摸索和优化,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,ELP-p35融合蛋白的相对分子质量大小约为80 000;制备获得的无标签p35蛋白能够被非洲猪瘟阳性血清所识别;抗原包被最佳质量浓度为2.00μg/ml,待检血清最佳稀释比例为1∶200,二抗最佳稀释比例为1∶10 000,阴性和阳性判定阈值OD450为0.171;与口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病毒(PRV)等阳性血清无交叉反应,特异性好;批内、批间试验结果显示变异系数都小于5.000%,重复性好;可检测400倍稀释的血清,敏感性较高;与商品化检测试剂盒(ING)检测结果的符合率高达100%。结果表明,用本研究制备的A... 相似文献
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为评估规模化猪场生物安全防控水平,拟建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染性检测方法,并利用该方法检测兽用消毒剂对病毒的灭活效果。使用不同种类的消毒剂处理ASFV,通过PMA-qPCR评估消毒剂对ASFV的灭活效果和筛选消毒剂的最佳处理方式。PMA-qPCR结果显示,ASFV对不同类型的消毒剂表现出不同的敏感性,对过硫酸氢钾复合物溶液敏感性最高,该消毒剂按0.5%稀释,20 min内即可有效灭活ASFV。研究结果对生物安全的消毒环节具有一定的参考意义。 相似文献