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1.
获得全长cDNA 序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提.我们根据已获得的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列.另外,采用反向嵌套PCR RACE法,根据caBD-1 cDNA的已知序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA 进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功的克隆了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的5′末端序列.本研究扩增出的caBD-1 cDNA序列全322 bp,其中包含一个由192 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD-1肽. 相似文献
2.
为进一步研究驯鹿伊防御素-1（reBD-1）基因的分子结构，利用已克隆出的reBD-1部分片段，设计了1条特异性上游引物，并以反转录引物中的部分序列即3sites Adaptor Primer作为下游引物，采用3’RACE技术成功克隆了reBD-1 cDNA的3’末端序列。通过与已知reBD-1片段拼接，得到了192bp的完整开放读码框（ORF）、终止密码子TAA、118bp的3’非翻译区（3’UTR）以及poly（A）1S,其中ORF编码具有64个氨基酸残基的reBD-1前原肽。 相似文献
3.
为获得骆驼β-防御素基因（caBD-1cDNA）的全长序列，采用锚定PCRRACE技术，根据已获得的骆驼伊防御素基因的部分已知序列，设计了1条特异性引物作为上游引物，将反转录引物中的部分序列即3’接合器引物作为下游引物，成功地克隆了caBD-1cDNA的3’末端序列；采用反向嵌套PCRRACE技术，根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列，设计了1条5’末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物，首先进行反转录（RT），然后将mRNA反转录的cDNA进行环化，最后进行反向嵌套巢式PCR，成功地克隆了骆驼伊防御素caBD-1cDNA的5’末端序列。结果显示，获得了骆驼伊防御素caBD-1cDNA基因的全序列。证实，RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。 相似文献
4.
为了研究Ghrelin在驯鹿生长发育过程中的作用和功能,以驯鹿为研究对象,采用反向嵌套PCR RACE技术原理,根据已知的序列设计1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地扩增了驯鹿Ghrelin cDNA 5′末端序列。与锚定PCR相比,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点,是一种非常有效的扩增cDNA 5′末端序列的方法。 相似文献
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为了研究Ghrelin在驯鹿生长发育过程中的作用和功能,以驯鹿为研究对象,采用反向嵌套PCR RACE技术原理,根据已知的序列设计1条5'末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地扩增了驯鹿Ghrelin cDNA 5'末端序列.与锚定PCR相比,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点,是一种非常有效的扩增cDNA 5'末端序列的方法. 相似文献
6.
为了检测reBD-1 mRNA在驯鹿体内可能的表达器官,研究根据已知的reBD-1 cDNA序列设计了一对预计扩增产物为121 bp的引物,以驯鹿舌、食管、瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、回肠、结肠、肝、肺、气管、肾、膀胱、睾丸、附睾、心脏、脾脏中提取的总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)技术检测驯鹿的上述器官内reBD-1 mRNA的表达情况.结果显示:reBD-1 mRNA在上述组织器官中均有表达,其中在舌、瘤胃、睾丸中表达最强;在食管、十二指肠、结肠、气管、脾脏中有中等量的表达;在网胃、皱胃、回肠、肝、肺、肾、膀胱、附睾、心脏内的表达较弱.β-防御素reBD-1在驯鹿体内的广泛表达提示reBD-1有助于驯鹿的先天性宿主防御. 相似文献
7.
《中国畜牧兽医》2017,(3)
为了获得梅花鹿β-防御素-1(sika deerβ-defensin-1,siBD-1)cDNA全序列,本试验以梅花鹿舌黏膜组织内提取的总RNA为模板,根据前期已获得的siBD-1cDNA的已知部分序列设计引物,采用5′-RACE和3′-RACE技术分别扩增5′-和3′-末端序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,成功克隆出长度约为172和299bp的siBD-1cDNA 5′-和3′-末端序列,从而得到418bp的siBD-1cDNA全序列(GenBank登录号:HM588696.1),其中包含89bp 5′-非翻译区(UTR)、192bp的开放阅读框(ORF)、终止密码子TAA、118bp的3′-UTR和Poly(A)16。同源性比对结果显示,siBD-1cDNA与水牛的肠防御素(BEBD)同源性最高,为90.6%,与牛(EBD、LAP、TAP、BNBD-4)、山羊(GBD-1、GBD-2)、驯鹿(reBD-1)、绵羊(sBD-1、sBD-2)和骆驼(caBD-1)的防御素cDNA的同源性较高,分别为83.2%、83.1%、87.3%、87.0%、87.5%、87.5%、84.4%、79.9%、77.1%和70.5%;与马(hoBD-1)和猪(pBD-1)的同源性较低,为60.3%和72.4%;而与人(hBD-2)的同源性最低,为16.0%。siBD-1成熟肽由38个氨基酸残基组成,其中包含9个带正电荷的氨基酸残基。 相似文献
8.
为了获得梅花鹿β-防御素-1（sika deer β-defensin-1,siBD-1）cDNA全序列,本试验以梅花鹿舌黏膜组织内提取的总RNA为模板,根据前期已获得的siBD-1 cDNA的已知部分序列设计引物,采用5'-RACE和3'-RACE技术分别扩增5'-和3'-末端序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,成功克隆出长度约为172和299 bp的siBD-1 cDNA 5'-和3'-末端序列,从而得到418 bp的siBD-1 cDNA全序列（GenBank登录号：HM588696.1）,其中包含89 bp 5'-非翻译区（UTR）、192 bp的开放阅读框（ORF）、终止密码子TAA、118 bp的3'-UTR和Poly（A）16。同源性比对结果显示,siBD-1 cDNA与水牛的肠防御素（BEBD）同源性最高,为90.6%,与牛（EBD、LAP、TAP、BNBD-4）、山羊（GBD-1、GBD-2）、驯鹿（reBD-1）、绵羊（sBD-1、sBD-2）和骆驼（caBD-1）的防御素cDNA的同源性较高,分别为83.2%、83.1%、87.3%、87.0%、87.5%、87.5%、84.4%、79.9%、77.1%和70.5%;与马（hoBD-1）和猪（pBD-1）的同源性较低,为60.3%和72.4%;而与人（hBD-2）的同源性最低,为16.0%。siBD-1成熟肽由38个氨基酸残基组成,其中包含9个带正电荷的氨基酸残基。 相似文献
9.
中国驯鹿生长素(ghrelin)全长cDNA的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2014,(10):1647-1652
采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),在本课题组已获得的驯鹿ghrelin cDNA的部分片段的基础上进行3′和5′RACE。结果成功克隆出驯鹿ghrelin cDNA的3′和5′末端序列,从而得到604bp的驯鹿ghrelin cDNA全序列,其中包含57bp 5′非翻译区(UTR)、405bp的开放读码框(ORF)、128bp的3′UTR和poly(A)14。405bp的ORF编码134个氨基酸残基的前原ghrelin(preproghrelin),其中包含41个氨基酸残基的N末端信号肽,27个氨基酸残基的成熟肽及66个氨基酸残基的C末端肽。序列同源性比较显示驯鹿ghrelin cDNA与山羊、绵羊和牛的同源性分别是92.0%、90.8%和89.5%;与猪和人的同源性分别是69.5%和65.2%;与鸡的同源性仅为33.8%。表明ghrelin的结构具有明显的种属特异性。驯鹿Ghrelin cDNA全序列的获得为进一步研究其生理作用奠定了基础。 相似文献
10.
为构建缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5′非编码区(5′UTR)克隆,分析5′UTR的转录调控规律,以质粒WZSP-293-5′UTR为模板,应用重组PCR方法分别扩增5′UTR与缺失引物结合区及前导序列(PBS-Leader),即5′UTR(5′长末端重复区)、U3区、R区、U3区中重复序列的5′UTR等5种PCR片段,并分别将其克隆至T载体上,挑取阳性克隆,酶切鉴定插入方向,选择正确方向插入的克隆,测序并进行序列分析。结果表明,构建了系列功能区缺失的5种5′UTR克隆,分别命名为UTR-PMD、LTR-PMD、UTR-U3-PMD、UTR-R-PMD、UTR-U-PMD以备后用。结论:在PERV 5′UTR的不同功能区中含有一系列可能的转录因子结合位点;中国五指山猪内源性反转录病毒(WZSP-PERV)在293细胞中传代时,不仅U3重复区数目增加,重复亚型也发生了一定的改变。 相似文献
11.
佳米驴β防御素aBD-1基因克隆及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为获得佳米驴β防御素-1(aBD-1)的全长cDNA序列,为开发其药用功能积累资料。从佳米驴舌黏膜上皮组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出aBD-1(ass-βdefensin-1)cDNA的中间片段后,再采用RACE法,扩增佳米驴β防御素aBD-1的cDNA全序列。aBD-1 cDNA全序列长为360 bp,其中包含192 bp的开放阅读框,37 bp的5′非翻译区(5′UTR),102 bp的3′非翻译区(3′UTR)以及poly(A)26。在GenBank上注册号为EU265778,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与马β防御素eBD-1、牛的β防御素TAP、绵羊的β防御素sBD-1、猪的β防御素pBD-1和人的β防御素hBD-2的同源性分别为92%、68%、75%、75%和68%。aBD-1全长cDNA是β防御素家族中的一个新基因。 相似文献
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野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。 相似文献
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驯鹿β-防御素reBD-1 cDNA的克隆及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
从驯鹿舌黏膜上皮组织中提取总RNA，采用RT—PCR技术扩增出reBD-1的cDNA，并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定，证实所克隆的reBD-1的cDNA为β-防御素，因为该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素，该前原防御素含有伊防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。驯鹿β-防御素属首次发现，为更好地了解驯鹿黏膜防御机制有很大的帮助。 相似文献
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在对家蚕蛹cDNA文库的测序中发现了脂多糖诱导肿瘤坏死因子α的转录激活因子(lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-α factor,LITAF)的EST序列(GenBank登录号AADK01016184)。经过比对发现BmLI-TAF全长为981 bp,由97 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)、390 bp的开放读码框(ORF)和494 bp的3′端非翻译区序列(3′UTR)组成。用电子克隆方法对BmLITAF进行基因结构分析发现,此基因由3个外显子和2个内含子组成,编码129个氨基酸。对BmLITAF蛋白进行疏水性、跨膜结构和信号肽分析的结果显示,BmLITAF具有跨膜结构域。根据BmLITAF的电子克隆序列由家蚕基因组PCR扩增获得BmLITAF基因,将其克隆到pGEM-T-easy载体中,测序验证与电子克隆结果一致。 相似文献
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本研究克隆了b0,＋AT-2的全长cDNA序列。基于NCBI发布的人和鼠b0,＋AT序列,应用生物学软件进行序列比对后在同源区设计引物,获取cDNA片段;再利用RACE技术克隆了其全长cDNA序列。生物信息学分析显示：猪b0,＋AT-2的全长1 488 bp,包括90 bp的3′非翻译区（UTR）和126 bp的5′UTR;编码区（CDS）编码423个氨基酸残基,分别和人、鼠b0,＋AT以及猪b0,＋AT-1有75.1%、71.9%和86.6%的同源性。 相似文献
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沙打旺埃里砖格孢(Embellisia astragali)引起的黄矮根腐病是造成沙打旺(Astragalus adsurgens)草地退化最严重的病害之一。钙调素是Ca2+介导的信号通路中重要的分子。本研究旨在从沙打旺埃里砖格孢中克隆钙调素编码基因序列。以基因组DNA为模板,采用简并引物CAL-228F和CAL-737R扩增得539bp的同源片段;采用Hi-TAIL PCR分别获得344bp的5′侧翼序列和729bp的3′侧翼序列,拼接获得基因的1 290bp的全长DNA序列;利用全长引物CaMF和CaMR,得到840bp的DNA全长序列和450bp的cDNA全长序列,DNA全长序列中有4个内含子,均具有典型的AT-AG特征,cDNA全长序列翻译出149氨基酸多肽。 相似文献
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旨在构建驯鹿β防御素-1(Reindeerβ-defensin-1,reBD-1)基因的原核表达载体pET-32a(+ )/reBD-1,诱导reBD-1融合蛋白在大肠杆菌中表达,并对其表达产物的生物学活性进行评价.利用RT-PCR技术扩增reBD-1前原肽.从重组克隆载体PMD19T/reBD-1中扩增reBD-1成熟肽编码基因,并克隆入pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21 (DE3)中用IPTG诱导表达reBD-1融合蛋白.表达的融合蛋白扩大培养,进一步纯化后进行体外抑菌试验.结果表明,reBD-1前原肽和成熟肽扩增产物大小分别为215和138 bp,目的基因的序列与驯鹿防御素-1 mRNA序列同源性为100％.前原肽和成熟肽融合蛋白分子量分别为28和24 ku.利用琼脂糖扩散法表明,0.08 mg·mL-1的纯化成熟肽蛋白对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的活性有明显抵抗作用.结果显示,reBD-1前原肽及成熟肽在大肠杆菌中得到了高效表达,其成熟肽对革兰氏阳性菌和阴性菌的活性有抗性. 相似文献
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柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。 相似文献