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为建立能快速检测猪蓝耳病病毒（PRRSV）的检测方法,本研究根据基因库中PRRSV非结构蛋白NSP2基因的保守序列,设计了一套特异性环介导等温扩增（RT-LAMP）引物,建立了PRRSV的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10 copies RNA,高于常规PCR方法 10倍;全部反应可以在50 min内完成;可通过肉眼观察钙黄绿素（calcein）颜色变化直接判定结果;对其它常见病原体的检测结果均为阴性,同时应用实时浊度仪对反应体系浊度及浊度的变化速率进行实时测量,结果相一致。结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于PRRSV感染的快速检测。 相似文献
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H9亚型禽流感病毒环介导等温扩增检测方法的建立与荧光指示剂的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
利用反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了一种特异、灵敏、便捷的H9亚型禽流感病毒(H9subtype of avian influenza virus,H9-AIV)的检测方法。该方法使用了对应于H9亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin HA)基因的8个不同区域的6条特异引物,在63℃的等温条件下反应,最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段,较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的检测表明,该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定,并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测,RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为61份和46份,表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。 相似文献
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为获得稳定表达及较好免疫效力的重组NNV衣壳蛋白,对已公布的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列进行优化,并构建表达载体p ET32a-NNV,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导、表达,将包涵体纯化后碾磨成粉添加到黄粉虫饲料中,用虫体粉末喂食石斑鱼,攻毒保护试验检测免疫效力。结果获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体,目的蛋白占总蛋白的比率达70%,纯化后纯度达95%;且喂食本技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼对NNV抵抗力显著提高,存活率由5%上升至83%。本研究提供一种重组NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化方法,为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广奠定了基础。 相似文献
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为获得肉制品中牛、羊、猪、鸡、鸭等动物源性成分的快速高效多重PCR检测方法,利用5对牛、羊、猪、鸭和鸡等动物源性成分特异性PCR引物(靶基因序列来源于线粒体基因组),对多重PCR反应条件引物浓度和退火温度进行优化,并确定该检测方法的检出限。结果表明,多重PCR方法最佳反应条件为鸭源特异性引物浓度0.12μmol·L~(-1),鸡源特异性引物浓度0.16μmol·L~(-1),猪源特异性引物浓度0.16μmol·L~(-1),羊源特异性引物浓度0.32μmol·L~(-1),牛源特异性引物浓度0.24μmol·L~(-1),退火温度58℃,d NTPs浓度0.20 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶添加量5 U,循环次数40。在最佳反应条件下,所建立的牛、羊、猪、鸡和鸭等5种动物源性成分多重PCR的g DNA检出限达到20 pg。应用优化后的多重PCR方法对21份市售肉制品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性,结果与现行标准的检测结果一致,掺假率达42.86%。本试验结果为肉制品中该5种动物源性成分的快速检测提供了技术支撑。 相似文献
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荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用 总被引：5，自引：0，他引：5
介绍了一种应用荧光显色的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的检测方法.该方法使用了针对靶序列M+N基因的一组引物,并且能在63 ℃等温条件下30 min内完成反应.在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒.几种其它病原的核酸也被用来比较这两种方法的特异性,两种方法只能检测PRRSV.在荧光显色剂应用试验中,证实0.05 mmol/L钙黄绿素以及0.6 mmol/L锰离子可以用于LAMP扩增产物的判断,并且其判断结果与浊度判断结果一致.在对103个临床血液样本的检测中,RT-LAMP与RT-PCR检出的阳性样本数量分别是56个和48个.结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可以快速检测PRRSV. 相似文献
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为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR Green Ⅰ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR Green Ι为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。 相似文献
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为建立耐除草剂转基因作物的高通量检测方法,本试验以目前生产上广泛应用的5种除草剂抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar和aad1为靶标进行多重PCR(MPCR)研究。通过引物适用性测试、反应体系中的不同引物浓度和反应程序中的退火温度测试、灵敏度和特异性验证等,建立了能同时检测5种除草剂抗性基因的MPCR检测方法。结果表明,当dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1基因的检测引物终浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.2μmol·L-1,退火温度为63℃时5种靶标扩增效果较好,且特异性条带清晰且均一。此外,MPCR检测方法具有较好的特异性,对每种靶标的检测灵敏度均可达到0.1%。适用性测试结果显示,MPCR检测方法可对含有5种除草剂抗性基因的多种转基因作物的单个品系或多个品系混合物进行筛选检测。无假阳性和假阴性结果表明,MPCR检测方法对实际样品具有很好的适用性。本试验结果为筛选高效耐除草剂转基因作物检测技术提供了一定的理论依据。 相似文献
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环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因玉米LY038 总被引：3，自引：0，他引：3
为了施行对转基因作物的监管,许多国家和机构制定了转基因标识制度的相关条例,因此建立针对转基因产品的检测方法是十分必要的.本研究运用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了对转基因玉米(Zea mays L.) LY038外源基因的快速检测技术,该方法依据cordapA基因的序列设计了4条特异性引物,结果表明,引物特异性良好,该检测体系在63℃恒定温度下,反应50 min,可检测到0.01％的样本,是常规PCR方法的5倍.该检测方法具有高度的特异性、灵敏性和稳定性,该方法不需要特殊仪器、快速简便,在基层和现场检测中有很好的应用前景. 相似文献
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采用微滴数字PCR(ddPCR)技术,建立RT-ddPCR快速定量检测GⅡ型诺如病毒的方法。反应条件的退火温度为55℃,反应体系引物探针浓度分别为1、 0.25μM。建立的GⅡ型诺如病毒RT-ddPCR方法的特异性和稳定性好;在单位体积内拷贝数20~60 000区间内呈现良好的线性关系, R2=0.997。本方法可以对单位体积拷贝数为20的样品进行稳定的定量检测,对单位体积拷贝数为6.6的样品进行稳定检测。精密度结果表明, 4组浓度的样品所得到的组内RSD值为2.86%~23.59%之间,均<25%;对23个贝类样品的检测结果与荧光PCR检测结果一致。本研究建立的GⅡ型诺如病毒的RT-ddPCR定量检测方法可用于贝类样品诺如病毒的快速定量检测。 相似文献
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本研究旨在开发传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)现场检测新技术,用于鉴定鱼类苗种是否携带IHNV,降低疫病传播风险,实现水产健康养殖管理。基于IHNV基因组序列保守性分析结果,以保守性最高的基质蛋白编码基因(matrix,M)为检测靶序列,设计了6条IHNV特异性扩增引物,对样品RNA进行逆转录等温链置换扩增。在部分引物5’端标记二茂铁分子,使扩增产物带有电化学信号,在部分底物中标记生物素分子,使扩增产物被亲和素修饰的电极表面捕获锚定,基于该原理构建了电化学生物传感体系,通过检测扩增产物的循环伏安信号,判断样品中是否携带IHNV。本方法能够在15 min内完成核酸扩增,且扩增反应在59~65℃的宽松温度区间内均可进行,无需精准控温,对设备和操作要求较低。在扩增温度63℃、信噪比为3的条件下,本方法最低检测限(limit of detection,LoD)为6.2 copies/μL,能够对未表现出感染症状的鲑鳟类鱼苗、鱼卵进行IHNV检测,适用于苗种场、养殖场等生产经营性场所的现场检测,在水产苗种鉴定领域具有良好的应用前景。 相似文献
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环介导等温扩增技术对牛奶中沙门氏菌快速检测的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的基因扩增方法,它具有高特异性、高灵敏度、便捷、成本低等特点,因而广泛应用于临床检测.本实验以沙门氏菌高度保守基因fimY基因为靶基因设计两对引物(F3&B3、FIP&BIP),建立LAMP反应体系.经试验分析对体系特异性、Mg2+浓度、反应时间、反应温度进行了优化和摸索,对35株临床菌株均检出达100％,其他阴性菌株基因组均无检出,在人工添加样品检测得其在牛奶中灵敏度为33CFU/管.实验结果表明,该方法耗时少、具有高特异性,适合牛奶中沙门氏菌污染的快速检测. 相似文献
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三种对虾病毒多重实时荧光PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库中白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）和桃拉综合征病毒（TSV）的基因序列,设计了WSSV 、IHHNV和TSV的三对特异性引物和三条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测WSSV 、IHHNV和TSV的三重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对WSSV 、IHHNV和TSV的检测敏感性分别达到20000、20和20000个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对WSSV 、IHHNV和TSV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这三个病毒。对保存的45份经常规PCR检测仅为WSSV 、IHHNV和TSV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中2份为WSSV和IHHNV混合感染。本研究建立的三重实时荧光PCR方法用于WSSV、IHHNV和TSV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。 相似文献
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为了提高检测效率,本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增核酸,用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测产物,建立了一种山茶根结线虫(Meloidogyne camelliae)的LAMP-LFD快速检测新技术.以山茶根结线虫核糖体DNA内转录间隔区(ribosomal DNA-intemal transcribed spacer,rDNA-ITS)为检测靶标,设计3对特异性引物进行生物素标记的实时荧光LAMP反应,优化后的LAMP扩增条件为63℃反应15 min.比较LFD、实时荧光曲线以及琼脂糖凝胶电泳等3种产物检测方法,结果表明,LAMP产物与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针ITS-HP杂交5 min后即可在LFD上显色,从LAMP反应开始到LFD结果判断仅需25min,比常规PCR技术缩短约2h.LAMP-LFD技术能特异性地检测山茶根结线虫,对其基因组DNA的检测灵敏度为4 pg/μL,低于常规PCR方法100倍;对其单条2龄幼虫(J2)检测灵敏度为1/1 000条线虫.本研究建立的快速、灵敏、特异性LAMP-LFD检测技术可应用于山茶根结线虫的口岸检验. 相似文献
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GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。 相似文献
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药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化 总被引：2，自引：1，他引：1
基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果标明：药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为：在20μL的反应体系中,模板DNA 60ng,Taq酶1.00U,Mg2+ 2.00mmol•L-1,dNTP 0.20mmol•L-1,引物0.40μmol•L-1。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。 相似文献
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牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用. 相似文献
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热不对称性PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL—PCR）是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应，选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增。TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行，反应高效灵敏，产物特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经在分子生物学研究领域广泛应用。本文从TAIL-PCR技术原理出发，对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述，并介绍TAIL—PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景。 相似文献
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利用环介导等温扩增技术快速检测水产品中的副溶血弧菌 总被引：7，自引：0，他引：7
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌。首次将环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）设计四条特异性引物,建立了副溶血弧菌LAMP检测方法,1 h即可完成。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅副溶血弧菌得到阳性结果,证明引物具有很高的特异性;副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为90 fg/LAMP反应体系和24 cfu/mL,对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89 cfu/g;对40份水产样品进行检测,8份副溶血弧菌LAMP阳性,其中6份传统培养阳性。本研究表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、快捷、检测成本低,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。 相似文献
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为了规范食品安全标识,防止非食用性的狐狸肉添加到肉品中导致伦理、宗教等敏感问题,迫切需要建立狐狸肉源性成分鉴定方法。本研究以狐狸、牛、羊、猪、鸭、驴和鼠肉以及模拟掺假样本为研究对象,根据狐狸线粒体基因序列设计特异性交叉引物组合,Bst DNA聚合酶反应体系经63℃恒温扩增60 min,扩增产物经电泳检测和一次性核酸试纸条检测,显示结果一致,建立了交叉引物等温扩增技术与核酸试纸条检测结合的快速检测狐狸源性成分的方法。本研究建立的狐狸肉源性成分特异性的等温扩增体系,对单一狐狸源性DNA成分的灵敏度为10 ng·μL-1,对狐狸肉与羊肉混合物中狐狸肉成分的检出比例为1%,可为肉制品市场现场检测提供简便、经济、快速有效的技术支持。 相似文献