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1.
研究旨在证明犬细小病毒(CPV)悬浮培养的可能性,提高CPV P6株抗原的病毒含量,降低转瓶生产不同批次间疫苗质量差异,生产质量稳定的疫苗产品。试验利用大孔的纤维编织物BioNOCⅡ型微载体所提供的巨大表面积,实现Vero细胞高密度培养,建立了Tide-cell生物反应器大规模培养CPV P6株抗原制备工艺。结果显示：生物反应器Tide-cell载体罐内接入1.0×1010个F81种子细胞,在优化的参数条件下培养,用RPMI 1640培养液经过96 h培养,细胞总数为1.0×1011个;在葡萄糖消耗量约为5 g/(L·h)时,按照病毒感染复数(MOI)=0.02将生产种毒CPV P6株接入Tide-cell微载体细胞培养瓶内,补加含8%血清的RPMI 1640病毒维持液至50 L,调整pH值为7.2～7.3,培养48 h收获,病毒含量至少为107.43 TCID50/mL。 相似文献
2.
通过将猪细小病毒CG-05株同步接种于ST细胞,测定不同时间收获的病毒液的TCID50和HA,研究了CG-05株病毒在ST细胞上的增殖规律。病毒接种后镜检观察接毒细胞,在接种病毒后24 h,即可在细胞较少的区域看到非常轻微的病变。测定病毒TCID50,检测到接毒后培养17h病毒已经明显增殖;当培养到40h左右,其TCID50即接近高峰,达到10-7.2/0.1mL以上,并进入平台期;继续培养,TCID50最高可达到10-8.5/0.1mL,且直到122 h也不见明显降低。病毒HA价也出现同样的平台期,但比TCID50的平台期出现得晚,到50 h才进入平台期。结果表明,用ST细胞培养CG-05株病毒,接种病毒培养56～96 h后,如病变达到80%以上,且细胞脱落已形成20%以上空斑,此时收获病毒可获得高效价的病毒液。该研究可为制备高效价的PPV病毒抗原提供数据资料。 相似文献
3.
为建立新城疫病毒在BHK-21细胞的无血清全悬浮培养工艺以获得高滴度和高纯度的新城疫悬浮培养抗原,通过悬浮培养驯化和筛选获得了形态良好、稳定传代的BHK-21-sc悬浮细胞株;该细胞以初始密度0.5×10~6 cells/mL接种,培养72 h可增殖到6×10~6cells/mL,细胞活率达95%。以5 L生物反应器悬浮培养BHK-21-sc细胞,对鸡新城疫病毒La Sota株的接毒剂量、TPCK胰酶添加浓度、病毒培养温度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化;并在5L-16L-50L生物反应器中进行逐级放大,以优化后的鸡新城疫悬浮培养工艺进行3个批次病毒悬浮培养。最终确定鸡新城疫病毒La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞株的悬浮培养工艺:BHK-21-sc细胞悬浮培养的第3天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.005接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的TPCK胰酶,于33℃培养72 h后收获病毒液。应用该悬浮培养工艺在5、16、50 L反应器上悬浮培养BHK-21-sc悬浮细胞株生产鸡新城疫病毒HA滴度不低于9log2,病毒含量不低于10~(6.0)TCID_(50)/0.1mL。表明BHK-21-sc细胞无血清全悬浮生产鸡新城疫病毒工艺稳定,可以实现逐级放大和规模化生产。 相似文献
4.
为了大规模生产猪传染性胃肠炎病毒抗原,试验采用生物反应器及微载体进行ST细胞的培养,待微载体上的ST细胞长满至单层后接种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).共使用生物反应器培养3批TGEV抗原,每批培养过程中分别调节初始细胞密度至2.14×106个/mL、1.83×106个/mL和2.02×106个/mL,微载体浓度为3g/L、6 g/L和9 g/L.结果表明应用生物反应器及微载体培养得到抗原的病毒含量均达到108.0 TCID50/mL,明显高于转瓶培养的病毒含量. 相似文献
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为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。 相似文献
6.
为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养，本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株；使用该细胞以初始密度为100×104个/mL接种摇瓶进行培养，并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化；利用摇瓶优化的病毒培养工艺，在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞，接种鸡新城疫病毒；采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示，在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×104个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×104个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒，同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶，于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液，鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log... 相似文献
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本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID50)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID50绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID50、鸡胚半数感染量(EID50)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为106.375 EID50,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID50值为107.0/0.1 mL,EID50为107.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(1)
为了研究马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus 1,EHV-1)在不同细胞系中的增殖规律,试验将该病毒分别接种至Vero细胞、BHK-21细胞和MDBK细胞中进行连续传代培养,观察细胞病变(CPE)情况;对第3代收获的病毒gE基因进行PCR检测及同源性比对;按照Reed-Meunch方法分别测量3种细胞7个时间点的TCID_(50),并绘制一步生长曲线。结果表明:EHV-1对3种细胞有很好的亲嗜性,产生明显CPE;3种细胞都扩增出大小为438 bp的片段,与所选的参考株同源性在99.99%以上;EHV-1在感染3种细胞后0～12 h进入静止期,12～48 h进入快速增长期;感染BHK-21细胞后在36小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)为1×10~(-8.40)/0.1 mL,感染MDBK细胞及Vero细胞后在48小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)分别为1×10~(-7.35)/0.1 mL和1×10~(-5.80)/0.1 mL。说明BHK-21细胞适合作为EHV-1-XJ2015株体外研究的细胞系。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(3)
为实现伪狂犬病病毒(PRV)的大规模生产,本研究应用Cephodex微载体悬浮培养BHK-21细胞,通过对培养工艺的研究,初步实现了病毒抗原的高效生产。整个过程采用流加方式和动物细胞微载体培养技术,在细胞反应器中进行BHK-21高密度培养和PRV的高滴度增殖。结果表明,微载体工艺比转瓶培养法获得的病毒液滴度高约100.525TCID50/0.1 m L。因此,应用Cephodex微载体悬浮培养BHK-21细胞在伪狂犬病疫苗规模化生产中具有重要的应用价值。 相似文献
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本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID_(50))的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID_(50)绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID_(50)、鸡胚半数感染量(EID_(50))与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10~(6.375) EID_(50),细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID_(50)值为10~(7.0)/0.1 mL,EID_(50)为10~(7.5)/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(8):89-92
为了探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)在微载体培养Vero细胞上的增殖效果,采用2 L生物反应器进行微载体培养Vero细胞和PEDV繁殖,并摸索细胞生长和病毒繁殖的最佳条件,检测病毒滴度,与方瓶培养的病毒滴度进行比较。结果显示:当微载体为5 g,种子细胞数约3.05×107个,采用灌注式培养,Vero细胞经72 h长满单层,细胞数约为3.02×109个,此时用滴度为104.45TCID50/m L的PEDV 1 m L感染Vero细胞,培养96 h,微载体上80%细胞脱落时收毒,培养的PEDV具有较高的病毒滴度。相同病毒在微载体系统与方瓶上进行同步传代,经检测病毒滴度均有提高,但在微载体系统上培养的PEDV最高滴度可达到106.05TCID50/m L,明显高于方瓶培养。本试验为研究PEDV能更好适应Vero细胞,提高PEDV产量提供技术支持。 相似文献
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本试验对比了不同的接毒方法,观察猪圆环病毒2型的繁殖情况.试验分为同步接毒(A组、B组)和异步接毒(C组、D组):同步接毒A组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入5%(V/V)的PCV2种毒,B组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入3%(V/V)的PCV2种毒,24 h后再接种2%种毒;异步接毒C组为在生长良好、 培养24 h的单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒,D组为在生长良好、培养48 h的PK15单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒.四组均在接种后培养72 h收获,进行病毒含量检测.试验结果显示:A组的病毒含量为107.0~7.25TCID50/mL,B组病毒含量为106.75~7.0TCID50/mL,C组的病毒含量为106.4~6.5TCID50/mL,D组的病毒含量为106.25~6.5TCID50/mL.试验结果表明,采用同步接毒法的病毒含量明显高于异步接毒法,在细胞悬液中同步一次性接入5%种毒,病毒的增殖量最高. 相似文献
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对在生物反应器中用微载体连续灌注培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备技术进行了研究.在14 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的细胞培养基DMEM,接种Marc-145细胞至细胞浓度为1×105/mL,培养4d后细胞可生长至5～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种PRRSV PC株病毒,接毒后36 h开始收获,连续收获3d左右,收获的病毒滴度范围在106.0～ 1073TCID50/mL之间,将收获的病毒液加入适量的保护剂,经冷冻干燥制备成疫苗,无菌、支原体等项目的检验均合格,3批疫苗的免疫保护率均为5/5.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养Marc-145细胞制备PRRS疫苗工艺可行. 相似文献
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应用激流式生物反应器培养Marc-145细胞生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,并通过工艺优化,实现了病毒抗原的高效生产。首先将Marc-145细胞用含6 0mL/L牛血清的DMEM培养液复苏放大培养,当细胞量达到3×109时,接种入反应器中。先用细胞生长液培养,当细胞达到最大量时更换生长液为维持液,并接种HP-PRRSV。整个过程采用流加方式,每8h采样测定培养上清中葡萄糖浓度。接种病毒后,每24h测定培养上清HP-PRRSV滴度。6个批次细胞生长至88h,糖耗达到最高水平。连续3个批次种毒后培养至96h,上清中HP-PRRSV滴度达到最高,平均约为每106.4 TCID50/0.1mL。因此,认为应用激流式生物反应器进行细胞培养,通过过程工艺优化,可以实现HP-PRRSV抗原的高滴度生产。 相似文献
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为了用激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗,采用纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞,接种狂犬病病毒Flury株(LEP),测定病毒液滴度.将收获的病毒液制备兽用狂犬冻干活疫苗,按照狂犬病活疫苗规程进行检验.结果显示,3批收获的病毒液滴度平均达1050LD50/0.03 mL;3批实验疫苗检验结果均符合质量标准.实验证明激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗提高了细胞密度、病毒滴度,增加了病毒液收获体积,减小了批间差,保证了产品均一性,适合工业化大生产. 相似文献
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将Siat7e基因转染ST细胞,筛选,驯化得到一株可悬浮培养的ST细胞株,此株细胞能够稳定连续传代,适应无血清、高密度培养,最高密度可达6×106/mL,从摇瓶放大至生物反应器,生长稳定;采用驯化的全悬浮ST细胞培养伪狂犬病毒,从接毒时细胞密度、接毒量、收获时间三个方面优化了伪狂犬病毒的培养参数,确定接毒时细胞密度为2.0×106/mL~3.0×106/mL,接毒量为0.1 MOI~1 MOI,收毒时间为接毒后24 h~36 h。经过50 L生物反应器3个批次的工艺验证,培养的病毒含量均不低于109.0TCID50/mL,说明驯化的ST全悬浮细胞适合伪狂犬病毒的培养。 相似文献
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猪乙脑病毒CSF.XZ-2D株的分离鉴定及其体外培养特性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解河南省规模化猪场日本乙型脑炎病毒(JEV)流行株的特征,本研究对临床流产胎儿脑脊液进行病毒盲传分离,经RT-PCR等分子生物学方法及乳鼠感染试验,分离鉴定了1株基因Ⅲ型JEV株,命名为CSF.XZ-2D。采用BHK-21细胞对该分离株的体外培养特性进行研究,结果表明,在25 cm2细胞瓶中,用1.25×106个细胞/瓶的初始量制备细胞单层,以较低剂量的病毒液吸附细胞并洗涤弃去游离病毒粒子,可在感染后60 h达到最大增殖量,病毒效价为105.0TCID50/0.1 mL以上。本研究为其他JEV分离株的体外培养提供了参考。 相似文献