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1.
《动物营养学报》2020,(3)
本试验采用体外法研究壳聚糖(CTS)对无乳链球菌(S. agalactiae)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)炎性损伤的保护作用。首先,采用不同浓度(0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1 000 mg/mL)的CTS处理BMECs 12和24 h后,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测BMECs活性,根据BMECs活性筛选出CTS的适宜作用时间(24 h)和作用浓度(31.25、125和250 mg/mL),用于后续试验。然后,采用双因素试验设计,以不进行CTS处理和S. agalactiae诱导的BMECs作为对照组,以S. agalactiae诱导6 h的BMECs作为S. agalactiae组,以不同浓度(31.25、125和250 mg/mL)CTS处理24 h的BMECs作为CTS组,以不同浓度(31.25、125和250 mg/mL)CTS处理24 h后再经S. agalactiae诱导6 h的BMECs作为CTS(-)+sgc组,每组4个重复。使用荧光定量PCR的方法检测各组BMECs的白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8、Toll样受体2(TLR2)、髓样分化因子88(MyD88)、白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和转化生长因子β活化激酶1(TAK1)的mRNA表达量,使用Western blot的方法检测各组BMECs的核因子-κB(NF-κB)抑制蛋白-α(IκB-α)、磷酸化NF-κB-p65(p-NF-κB-p65)、磷酸化p38(p-p38)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的蛋白表达量。结果显示:1)31.25和125 mg/mL的CTS显著或极显著降低了BMECs的IL-6、 IL-8、 TLR2、 MyD88、 IRAK4和TRAF6 mRNA表达量(P0.05或P 0.01);31.25、125和250 mg/mL的CTS极显著降低了S. agalactiae诱导的BMECs的IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8、TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6和TAK1mRNA表达量(P0.01)。2)31.25、125和250 mg/mL的CTS显著或极显著降低了BMECs和S. agalactiae诱导的BMECs的p-NF-κB-p65、p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达量(P0.05或P0.01)。由上述结果可知,CTS可以通过抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路转导来降低S. agalactiae诱导BMECs产生炎症反应,从而有效保护细胞,降低炎性损伤作用。 相似文献
2.
近年来,中药复方抗炎机制的研究不断深入,白头翁汤复方（Pulsatilla decoction,PD）作为经典的清热解毒中药方剂常用于预防和治疗细菌性腹泻。然而其抗炎机制和靶细胞研究仍然不明确,本课题以大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMVECs）为模式细胞,旨在研究白头翁汤对LPS诱导的RIMVECs炎症反应的调控作用。利用LPS刺激RIMVECs,通过荧光定量PCR（RT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）的方法检测白头翁汤对LPS刺激后RIMVECs的炎性信号通路TLR4-ERK1/2信号通路关键蛋白TLR4、TRAF6、ERK的mRNA及蛋白表达。进一步采用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测白头翁汤对LPS刺激后的炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌情况。结果表明：白头翁汤可以显著降低LPS诱导的TLR4、TRAF6、ERK的mRNA水平及蛋白表达并降低了LPS诱导的细胞下游炎性因子的分泌。白头翁汤通过抑制TLR4-ERK1/2信号通路缓解LPS所诱导的RIMVECs炎性反应,发挥抗炎作用。 相似文献
3.
旨在探究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子kappaB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)通路在β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHBA)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的分子作用机制。通过添加不同浓度的BHBA诱导奶牛乳腺上皮细胞MAC-T以模拟奶牛高酮血症中乳腺上皮细胞的炎性反应，并利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染细胞42 h后加入3.6 mmol/L BHBA再处理24 h;通过RT-qPCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)和IL-6等炎性因子的表达变化，并采用Western blot法测定TLR4/NF-κB通路关键蛋白的相对表达水平。结果表明，与对照组相比，不同浓度BHBA处理后，乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高，当BHBA浓度为1.2 mmol/L或以上时，p-NF-κB p65/NF-κB p65比值和TRAF6蛋白水平显... 相似文献
4.
《动物营养学报》2021,33(8)
本试验旨在探讨褪黑素(MT)对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)炎症反应的缓解作用及潜在机制。利用不同浓度(0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μg/mL)的LPS处理BMECs 6和12 h后,通过测定BMECs活性和炎性细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)]含量,确定10μg/mL的LPS诱导12 h用于正式试验。正式试验共设7组,每组设4个重复。对照组BMECs不进行LPS诱导和MT处理,LPS组BMECs进行LPS诱导12 h,LPS+MT组BMECs进行LPS诱导12 h后再经不同浓度(1、5、10、50和100μmol/L)MT处理48 h。结果表明:1)与对照组相比,LPS组BMECs中TNF-α含量升高(P 0.05), BMECs中IL-6和IL-1β含量显著升高(P 0.05)。与LPS组相比,10和50μmol/L MT组BMECs中TNF-α含量显著降低(P 0.05),1、5、10和100μmol/L MT组BMECs中IL-6含量显著降低(P0.05),10μmol/L MT组BMECs中IL-1β含量显著降低(P0.05)。2)与对照组相比,LPS组BMECs中Toll样受体4(TLR4)蛋白表达量升高(P0.05),BMECs中核因子-κB同源蛋白(P65)和核因子-κB抑制蛋白-α(IκB-α)蛋白表达量显著降低(P0.05)。与LPS组相比,50和100μmol/L MT组BMECs中TLR4蛋白表达量显著降低(P0.05),1、10和50μmol/L MT组BMECs中P65蛋白表达量显著或极显著升高(P0.05或P0.01),1、5、10和50μmol/L MT组BMECs中IκB-α蛋白表达量显著或极显著升高(P0.05或P0.01)。由此可见,MT能够降低LPS诱导的BMECs中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,调控LPS诱导的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表达量,MT可能通过参与核因子-κB炎症通路缓解LPS诱导的BMECs炎症反应。 相似文献
5.
为探究马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev负调控Tripartite motif-containing protein 5α(TRIM5α)介导的AP-1信号通路的机制,本研究将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TRIM5α基因的质粒及pGL3-AP-1-Luc(AP-1报告质粒)共转染HEK 293T细胞,采用荧光素酶试验检测Rev对TRIM5α激活的AP-1信号通路的影响;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TAK1、TAB2、P38和c-Jun基因的质粒及pGL3-AP-1-Luc共转染HEK 293T细胞,采用荧光素酶试验检测Rev对TRIM5α下游转导分子(TAK1、TAB2、P38、c-Jun)激活的AP-1信号通路的影响;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TAK1、TAB2、P38基因的质粒共转染HEK293T细胞,利用western blot试验分别检测TAK1、TAB2、P38的表达水平;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含P38基因的质粒共转染HEK 293T细胞后加入蛋白酶体抑制剂MG132,利用western blot检测P38蛋白的表达情况。结果显示,共转染EIAV-Rev-HA实验组中TRIM5α对AP-1的激活倍数为0.4,而共转染pcDNA3.1对照组中相应的激活倍数为26.0;共转染pEIAV-Rev-HA实验组中,TAK1、TAB2、P38和c-Jun对AP-1信号通路的激活倍数分别为7.7、0.1、0.6、9.8,而共转染pcDNA3.1对照组中对AP-1信号通路的激活倍数分别为60.0、1.5、6.3、12.0;转染pEIAV-Rev-HA+pP38-Flag组与转染pcDNA3.1+pP38-Flag组相比,前者P38蛋白的表达量显著降低;加入蛋白酶体抑制剂组则恢复了P38蛋白的表达。上述结果表明,EIAV Rev显著下调eqTRIM5α及其下游转导分子TAK1、TAB2、P38激活的AP-1信号通路,但不显著下调c-Jun激活的AP-1信号通路;EIAV Rev通过蛋白酶体途径降解P38蛋白的表达而抑制eqTRIM5α激活的AP-1信号通路。本研究结果为理解EIAV与宿主蛋白相互作用提供参考依据。 相似文献
6.
取SPF级昆明小鼠进行RT雾化攻毒。攻毒后每隔一段时间通过BCA法测定小鼠支气管灌洗液BALF上清中总蛋白浓度,ELISA法测定小鼠BALF中致炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β浓度,利用RT-PCR检测小鼠肺泡巨噬细胞TLR4及其信号通路mRNA的表达情况。结果显示:小鼠吸入1/150LD50剂量雾化RT后,BALF上清总蛋白浓度增加,IL-1β、TNF-α浓度12h时达到最高值,IL-6浓度48h达到最高值。攻毒后12,24h时TLR4表达高于空白组,差异显著(0.01P0.05);12h时MyD88表达高于空白组,差异极显著(P0.01)。12h时IRAK-1、IRAK-4、TRAF6表达高于空白组,差异显著(0.01P0.05)。结果表明:小鼠吸入1/150LD_(50)剂量雾化RT,肺部发生炎症且肺泡组织通透性增加;低浓度蓖麻毒素攻毒后可刺激肺泡巨噬细胞TLR4及其信号转导通路下游MyD88、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4等相关因子mRNA的表达,主要通过MyD88途径引起肺部炎症反应。 相似文献
7.
《动物营养学报》2020,(3)
本研究旨在研究壳聚糖(CTS)对无乳链球菌(S. agalactiae)引起的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎性反应的抑制作用和分子机制。试验用含不同浓度(0、15.625、31.250、62.500、125.000、250.000、500.000和1 000.000 mg/mL) CTS的脑心浸出液(BHI)培养基培养S. agalactiae,通过测定600 nm吸光度(OD)检测细菌活性;试验用含不同浓度(0、31.25、125.00和250.00 mg/mL)CTS的细胞培养基培养bMECs 24 h后,用S. agalactiae刺激细胞6 h,使用荧光定量PCR的方法检测白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、Toll样受体2(TLR2)、髓样分化因子88(MyD88)、白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和转化生长因子激酶1(TAK1)的mRNA表达量,使用Western blot的方法检测核因子-κB抑制蛋白-α(IκB-α)、磷酸化核因子-κB-蛋白65(p-NF-κB-p65)、磷酸化蛋白38(p-p38)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的蛋白表达量。结果表明:1) CTS呈浓度依赖性抑制S. agalactiae的活性。2)S. agalactiae极显著提高了bMECs的IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表达量(P0.01);31.25、125.00和250.00 mg/mL的CTS显著或极显著降低了S. agalactiae诱导的bMECs的IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表达量(P0.05或P0.01)。3)S. agalactiae极显著提高了bMECs的TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6和TAK1 mRNA表达量(P0.01);31.25、125.00和250.00 mg/mL的CTS显著或极显著降低了S. agalactiae诱导的bMECs的TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6和TAK1 mRNA表达量(P0.05或P0.01)。4)S. agalactiae显著提高了bMECs的IκB-α、 p-NF-κB-p65、 p-p38和p-JNK蛋白表达量(P 0. 05);31.25、125.00和250.00 mg/mL的CTS显著或极显著降低了S. agalactiae诱导的bMECs的IκB-α、p-NF-κB-p65、p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达量(P0.05或P0.01)。综上所述,CTS可以呈浓度依赖性抑制S. agalactiae活性。CTS通过抑制核因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的转导,减少了炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表达,从而减弱S. agalactiae诱导的bMECs的炎性损伤作用。 相似文献
8.
本试验旨在研究Toll样受体4(TLR4)信号通路关键基因在断奶仔猪不同组织的分布情况。选择12头杜×长×大断奶仔猪,屠宰,取脾脏、胸腺、肠道淋巴结、下丘脑、垂体、肾上腺、肝脏、腓肠肌、皮下脂肪、空肠和回肠组织。应用实时荧光定量PCR技术测定TLR4信号通路关键基因,包括TLR4、髓样分化因子(MyD88)、IL-1受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、核因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子(TNF)-α在各组织的mRNA表达水平。结果表明:TLR4信号通路关键基因在所检测的11个组织中均有表达,并且组织分布规律基本一致。总体看来,主要在免疫组织(脾脏、胸腺、淋巴结)表达量较高,在皮下脂肪和肠道(空肠、回肠)表达量居中,在其他组织中表达量较低。TLR4信号通路关键基因在不同组织中表达差异较大,可能与仔猪各组织对病原的识别和抵抗能力有关。 相似文献
9.
本试验旨在研究高浓度葡萄糖对牛肺泡巨噬细胞（BAMs）促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α释放的影响及其机制是否与RAGE-TLR4相关信号通路串扰有关。将BAMs随机分为正常糖组（NG）、高糖组（HG）、高糖+RAGE抑制剂组（H+F）、高糖+TLR4抑制剂组（H+T）及DMSO组,处理12 h后收集上清及下层细胞。采用qRT-PCR和Western blot检测细胞RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA及蛋白表达情况,ELISA检测上清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度。结果表明,高糖极显著上调RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65基因、蛋白表达水平以及上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度（P<0.01）;RAGE抑制剂与TLR4抑制剂均极显著抑制高糖引起的RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65基因、蛋白表达水平上调以及IL-1β、IL-6、TNF-α释放（P<0.01）,即RAGE与TLR4均在激活RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路中发挥调控作用。综上所述,高糖能够通过RAGE-TLR4串扰引起牛肺泡巨噬细胞释放促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α,进一步阐明了高糖促进牛肺泡巨噬细胞炎症反应的分子机制。 相似文献
10.
旨在研究重组克柔念珠菌(Candida krusei)14-3-3蛋白(rCK14-3-3)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的分子机制，为系统研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供理论依据。采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定；CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间；Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响；ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-12相对表达量的影响。结果显示：成功构建了pET-21a-BMH1重组表达载体，经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白，纯度达90%以上，浓度为0.2 mg·mL-1。与空白对照组相比，采用50μg·mL-1的rCK14-3-3作用MAC-T,TLR2、... 相似文献