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为探究马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev负调控Tripartite motif-containing protein 5α(TRIM5α)介导的AP-1信号通路的机制,本研究将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TRIM5α基因的质粒及pGL3-AP-1-Luc(AP-1报告质粒)共转染HEK 293T细胞,采用荧光素酶试验检测Rev对TRIM5α激活的AP-1信号通路的影响;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TAK1、TAB2、P38和c-Jun基因的质粒及pGL3-AP-1-Luc共转染HEK 293T细胞,采用荧光素酶试验检测Rev对TRIM5α下游转导分子(TAK1、TAB2、P38、c-Jun)激活的AP-1信号通路的影响;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TAK1、TAB2、P38基因的质粒共转染HEK293T细胞,利用western blot试验分别检测TAK1、TAB2、P38的表达水平;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含P38基因的质粒共转染HEK 293T细胞后加入蛋白酶体抑制剂MG132,利用western blot检测P38蛋白的表达情况。结果显示,共转染EIAV-Rev-HA实验组中TRIM5α对AP-1的激活倍数为0.4,而共转染pcDNA3.1对照组中相应的激活倍数为26.0;共转染pEIAV-Rev-HA实验组中,TAK1、TAB2、P38和c-Jun对AP-1信号通路的激活倍数分别为7.7、0.1、0.6、9.8,而共转染pcDNA3.1对照组中对AP-1信号通路的激活倍数分别为60.0、1.5、6.3、12.0;转染pEIAV-Rev-HA+pP38-Flag组与转染pcDNA3.1+pP38-Flag组相比,前者P38蛋白的表达量显著降低;加入蛋白酶体抑制剂组则恢复了P38蛋白的表达。上述结果表明,EIAV Rev显著下调eqTRIM5α及其下游转导分子TAK1、TAB2、P38激活的AP-1信号通路,但不显著下调c-Jun激活的AP-1信号通路;EIAV Rev通过蛋白酶体途径降解P38蛋白的表达而抑制eqTRIM5α激活的AP-1信号通路。本研究结果为理解EIAV与宿主蛋白相互作用提供参考依据。 相似文献
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本研究应用PCR方法检测了中国3种旧大陆猴(恒河猴、食蟹猴及藏酋猴)的TRIMCyp嵌合基因型个体的存在状况,并首次发现携带TRIMCyp嵌合基因中国品系恒河猴。同时本实验应用建立RT-PCR方法在mRNA水平上进一步检测了恒河猴和食蟹猴的TRIMCyp嵌合基因序列和特性。其编码的融合蛋白TRIMCyp丧失了对HIV-1复制的限制功能,推测具有该基因型旧大陆猴对HIV-1更易感,可用于建立新型的艾滋病非人灵长类动物模型。本研究结果将促进逆转录病毒跨种间传播的研究和建立HIV-1易感非人灵长类动物模型。 相似文献
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SLFN是一类干扰素诱导蛋白,还可以通过干扰素调节因子(IRF3)途径被病原体直接诱导表达。最新研究表明,SLFN11可通过抑制病毒蛋白合成,对慢病毒属的HIV-1具有明显抗病毒作用。为阐明SLFN11对马传染性贫血病毒(EIAV)的作用,本研究采用RT-PCR技术从健康马淋巴细胞中首次扩增获得SLFN11基因,构建了真核表达重组质粒pHA-eSLFN11。将其与EIAV的感染性克隆共转染HEK293T细胞,western blot检测结构蛋白的表达情况,并采用激光共聚焦试验分析SLFN11在亚细胞中的定位。研究结果显示,SLFN11能够促进EIAV结构基因(Gag)的表达,此外马源SLFN11(eSLFN11)与人源SLFN11(hSLFN11)明显定位不同。以上结果提示,eSLFN11与EIAV的作用明显区别于hSLFN11对HIV-1的限制作用,其机制有待进一步研究。 相似文献
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Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。 相似文献
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为鉴定抗猴免疫缺陷病毒(SIV)衣壳蛋白p27单克隆抗体(MAb) p27-A5、p27-C7和p27-D2所识别的抗原表位,本研究通过间接ELISA法相加试验对这3株MAbs结合抗原表位进行初步分析,并利用部分重叠的短肽对MAbs的结合抗原表位进行鉴定.结果表明p27-C7和p27-A5的结合抗原表位位于p27蛋白的aa61～aa76(氨基酸序列为61SEGCTPYDINQMLNCV76);p27-D2的结合抗原表位则位于aa191～aa206(氨基酸序列为191EQTDAAVKNWMTQTLL206).该结果为进一步深入了解p27的抗原特性和建立该蛋白的检测方法奠定了基础. 相似文献
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【目的】探索犬酸性核磷蛋白32（canis acidic （leucine-rich） nuclear phosphoprotein 32 ku,caANP32）对不同物种A型流感病毒（Influenza A virus,IAV） RNA 聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因（caANP32A、caANP32B及caANP32E）的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因（P＜0.05;P＜0.01）,在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因（P＜0.01;P＜0.05）,在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异（P>0.05）。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接变体：caANP32B_X1、caANP32B_X2和caANP32B_X3;caANP32E 基因具有2个不同剪接变体：caANP32E_X1和caANP32E_X2。通过分析ANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响发现,caANP32A和caANP32B均能支持犬流感病毒（H3N2GD11）和马流感病毒（H3N8JL89）RNA聚合酶活性,而对禽流感病毒（H9N2ZJ12）RNA聚合酶活性支持较低。caANP32B_X2剪接变体对哺乳动物流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力显著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3（P＜0.05）;而caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性。【结论】本研究初步解析了caANP32家族蛋白的组织分布及序列多态性,阐明了其对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用,为解析MDCK细胞作为流感病毒分离和疫苗生产细胞系的分子机制提供了新的借鉴。 相似文献
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为检测猕猴TRIM5基因序列CypA转座子插入TRIMCyp突变基因型个体,本研究建立了应用毛发PCR方法,在基因组水平初步检测猕猴属中TRIMCyp基因型方法,并从猕猴属食蟹猴中初步筛选出TRIMCyp突变基因杂合和纯合子个体。实验以平顶猴为阳性对照,无CypA插入的PCR扩增产物片段大小约为2 343 bp,纯合体为3 110 bp,而杂合突变体则为2 343 bp和3 110 bp。与从血液中提取基因组方法检测结果一致。该方法的建立,为进一步调查TRIMCyp嵌合基因型猕猴在中国的分布,以及研究逆转录病毒跨种间传播和建立HIV-1易感猕猴属动物模型提供了实验手段和平台。 相似文献
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为分析马经典MHC-Ⅰ类分子的多态性,本研究从马外周血单个核细胞提取总RNA,并采用RT-PCR方法对14匹马经典MHC-Ⅰ类分子(包括编码肽结合区的大部分区域、α3区、穿膜区以及胞浆区)进行扩增和序列分析.结果显示,14匹实验马各自具有2个～4个MHC-Ⅰ等位基因,其在不同马匹之间的表达呈现明显的差异性,主要分布在2个分支.尽管如此,各马匹间均表达具有1个或1个以上相同或高度同源的对应经典MHC-Ⅰ类分子的mRNA.该研究结果为正在开展的针对马传染性贫血病毒减毒疫苗核心蛋白(p26)以及其他免疫原的CTL表位的筛选提供基础数据. 相似文献
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