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1.
二温式多重RT-PCR同时检测两种主要兰花病毒的研究 总被引：6，自引：0，他引：6
根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CyMV)和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV)两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物，建立了二温式多重RTPCR同时检测两种病毒的检测方法。用该方法对感染两种病毒的植株总RNA模板进行扩增，结果同时得到2条大小与实验设计相符的769 bp(CyMV)、1 000 bp(ORSV)的特异性扩增带。用该方法对随机抽取的39个蝴蝶兰样品进行检测，结果11个样品检测出CyMV，阳性率28.2%；24个样品检测出ORSV，阳性率61.5%； 6个样品同时检测出两种病毒。 相似文献
2.
为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10-3fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10-2 fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。 相似文献
3.
《中国植保导刊》2021,(6)
针对南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, Ar MV)及菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)基因组中特异性较高的序列,分别设计了特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,建立了一种快速检测这两种植物病毒的多重DPO-RT-PCR方法,并评价其特异性、灵敏度及退火温度敏感性。设计的DPO引物特异性较强,Ar MV和BPMV可分别扩增出217 bp与800 bp的特异性条带,检测灵敏度均达0.02 ng/μL。该检测方法对退火温度不敏感。实际样本及模拟样本的检测结果均与国家标准方法一致。本研究建立的检测方法可应用于Ar MV、BPMV的快速筛查,为口岸检疫监管提供技术支撑。 相似文献
4.
异沙叶蝉可传播小麦矮缩病毒Wheat dwarf virus(WDV)和小麦黄条纹病毒Wheat yellow striate virus(WYSV)两种病毒。本文根据WDV和WYSV的基因序列分别设计两种病毒的特异性引物对,以含有上述两种病毒的异沙叶蝉样品总RNA为模板,以随机引物为3′端通用引物反转录获得cDNA,然后在同一个PCR反应体系加入两对引物,分别得到与预期相符的773 bp和322 bp扩增产物条带。通过对引物浓度、dNTP和rTaq用量以及退火温度等条件进行优化,建立了能在同一异沙叶蝉体内检测WDV与WYSV两种小麦病毒的双重RT-PCR方法。该双重PCR方法特异性强、敏感性高,可以快速准确地在一个体系里同步检测介体昆虫体内的两种病毒,有效地检测虫体内病毒带毒率,这些结果可为病毒预测预报和病害防治提供参考。 相似文献
5.
番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起番茄褪绿病毒病,给番茄生产造成严重危害。开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。利用番茄褪绿病毒外壳蛋白(CP)基因序列,设计特异性引物,建立了ToCV的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,同时分析了该方法的灵敏度和特异性。结果表明,建立的ToCV-RPA方法在38℃恒温下40 min可从ToCV阳性的番茄样品中扩增出246 bp的特异性条带。扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR方法的10倍,适用于ToCV的快速检测。 相似文献
6.
烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。 相似文献
7.
齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CymMV）是严重危害兰科植物的2种主要病毒。本研究根据病毒不同分离株外壳蛋白基因的保守序列,分别设计了ORSV与CymMV各自的特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高104倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对ORSV和CymMV的快速检测。应用该方法,从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。 相似文献
8.
小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV,与其他4种病毒(菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus)不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。 相似文献
9.
建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条的研制及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了实现兰花种植苗圃和口岸一线直接检测样品中建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus(CymMV)和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)的目的,我们研制了上述两种病毒联合免疫胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记单抗C10并固定于胶金垫上;将抗体5B7和4F3分别固定于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗鼠抗体包被固定于硝酸纤维素膜上作为质控线,经优化后组装胶体金试纸条。结果表明研制的联合试纸条特异性强,能够在10min之内同时检出两种病毒,操作简便。对两个种植苗圃的93份兰花样品进行实际检测所得结果与ELISA的检测结果符合性好(Kappa值分别为84.6%和86.7%),能满足兰花样品中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的初筛要求。 相似文献
10.
根据莴苣花叶病毒(Lettuce mosic virus,LMV)的外壳蛋白保守位点设计引物,并构建片段大小为428 bp的内标质粒,利用引物和内标质粒对可侵染莴苣的5种病毒和与LMV同属的3种病毒进行反转录重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)检测。结果表明,该方法特异性强,可从阳性样品RNA中扩增出大小为272 bp的目标片段,而其他7种病毒RNA、空白对照以及阴性对照均未扩增出条带;灵敏度高,能检测出稀释100倍的LMV RNA,与常规RT-PCR灵敏度一致;速度快,整个扩增过程只需要40 min,不需要特殊设备。本研究建立的RT-RPA检测方法可应用于LMV的快速检测。 相似文献
11.
12.
在云南省昆明市的文心兰栽培基地发现了具有病毒病典型症状的感病文心兰植株。感病样品在电镜下可观察到长460-500 nm的线状病毒粒体和长约300 nm的杆状病毒粒体中的一种或两种,分别与已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒粒体大小一致。感病样品可以和建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒血清中的一种或两种呈阳性反应。利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的特异性引物,运用RT-PCR方法可以扩增到与引物设计预期大小一致的核酸条带。由此证明,云南文心兰病毒病的病原是建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒中的一种或两种。 相似文献
13.
为调查广东省国兰病毒病发生情况,采用双抗体夹心-酶联免疫吸附测定(double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)法对采集自广州市、汕头市和韶关市兰花主产区的53份具有典型病毒病症状的国兰叶片进行检测,选取35份病叶应用RT-PCR技术对检测结果进行验证,并基于cp基因序列对检测到的病毒进行系统进化分析。DAS-ELISA检测结果显示,53份病叶中有44份检出病毒,总检出率为83.02%;其中,有14份仅检出建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV),有19份仅检出齿兰环斑病毒(Odontolossum ring spot virus,ORSV),有11份检出CymMV和ORSV复合侵染,检出率分别为26.42%、35.85%和20.75%。RT-PCR检测结果显示,35份病叶中有30份检出病毒,总检出率为85.71%;其中,有21份仅检出CymMV,有6份仅检出ORSV,有4份检出CymMV和ORSV复合侵染,检出率分别为60.00%、17.14%和11.43%,但未检测到其它病毒。表明广东省国兰病毒病害主要由CymMV和ORSV侵染引起。序列和系统进化分析显示,来源于不同地区和寄主的CymMV和ORSV分离物的cp基因序列极为保守,CP氨基酸序列相似性分别大于97.31%和93.67%,且CymMV和ORSV多样性种群的分化与寄主种属和地理隔离关系不大。 相似文献
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齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究 总被引：2，自引：0，他引：2
齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。 相似文献
15.
A tissue-print hybridization assay for the detection and localization of viruses in orchids is described. Orchid leaves were cut transversely and the cut surfaces were printed on to nitrocellulose paper. Because orchid leaves are often succulent, there is excellent transfer of plant sap to the membrane, resulting in clear tissue prints. The nucleic acid on the nitrocellulose membrane was then hybridized to radio-labelled cDNAs of cymbidium mosaic virus (CyMV) and odontoglossum ringspot virus (ORSV), and the viruses were detected by autoradiography. The assay was able to detect as little as 20 pg of purified virus, which is 2–3 orders of magnitude more sensitive than the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for CyMV. When tissue prints derived from different parts of the plants were used for hybridization, the method was able to show the distribution of viruses within the plants. On the basis of its sensitivity and ease of use, this method should find wide application in the detection and localization of viruses in orchids as well as in other succulent plants. 相似文献
16.
Virus diseases of orchids in The Netherlands 总被引：1，自引：0，他引：1
D. D. Jensen 《European journal of plant pathology / European Foundation for Plant Pathology》1970,76(3):135-139
The most commonly encountered virus diseases in orchid plants in The Netherlands are caused byCymbidium mosaic virus (CyMV) andOdontoglossum ringspot virus (ORSV), either singly or in combination. Data on host ranges are given.Samenvatting De meest algemeen voorkomende virusziekten van orchideeën in Nederland worden veroorzaakt doorCymbidium-mozaïekvirus (CyMV) ofOdontoglossum-kringvlekkenvirus (ORSV) of door een combinatie van beide virussen. Aan de waardplantenreeks van beide virussen wordt uitvoerig aandacht geschonken. 相似文献
17.
正病毒病是引起甘薯品质降低和减产的重要原因之一,现已报道30多种能侵染甘薯的病毒~([1,2])。山东省是甘薯种植大省,病毒种类近10种~([3,4])。甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFM V)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)是为害甘薯的主要病毒,在全国甘薯种植区广泛分布~([5,6])。甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)为Potyvirus的一个暂定种,多与同属的其他病毒混合侵染~([7])。多重PCR技术由Chamberian等~([8])1988年首次提出,可实现多基因的同时扩增,具有节省时间、提高效率的优点,已初 相似文献