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针对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了LCMV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测方法。该检测方法具有良好的特异性,与LCMV同步检测的其他鼠病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一样的高敏感性;通过对LCMV感染鼠组织样本和LCMV阴性鼠血清样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样20 min内即可判读结果,可满足啮齿类动物LCMV快速检疫需要。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2018,(10)
为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×10~1拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍。利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88%,高于普通PCR的检出率(82%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测。 相似文献
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为探索石河子地区的CPV野毒株是否发生遗传变异,本试验收集石河子地区自然发病犬及病死犬的粪便和组织,提取其病毒基因组,利用PCR技术对犬细小病毒VP2基因片段进行扩增,对扩增片段进行克隆和测序,并与不同地域流行株VP2基因进行比对,分析其差异。结果显示,本试验成功克隆了VP2基因,且序列分析结果显示一毒株存在14个点突变位点其和5个缺失位点,另一毒株存在7个突变位点。经基因型鉴定,野毒株的基因型均为CPV-2a型。 相似文献
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非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
非洲猪瘟是一种跨境动物疫病,对世界养猪业危害严重。目前,该病的流行范围越来越广。为防止该病传入我国,当前急需建立快速、简便、可靠的检测方法。本研究通过分析非洲猪瘟病毒B646L基因保守区域,设计并合成了特异性引物和exo探针,建立了检测非洲猪瘟病毒的实时荧光RPA方法。利用该方法可在20 min内完成检测过程,最低可检测到16拷贝/反应;与猪的其他常见病原核酸无交叉反应;与荧光PCR方法具有相似的灵敏度和特异性;利用该方法对100份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究所建立的非洲猪瘟病毒实时荧光RPA检测方法具有简单、快速、敏感性高、特异性强的优点,在临床鉴别诊断、检验检疫和病原监测等方面具有广泛的应用价值。 相似文献
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为建立一种能够快速鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GDr180疫苗株与GD野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究在PPRSV的Nsp2基因和Orf7基因区域分别设计不同荧光标记的MGB探针及特异性引物.这两种MGB探针能够分别特异结合GD野毒株和GDr180疫苗株.通过对PRRSV培养液、感染猪血清和组织样品检测证明了该方法的可行性;采用双重实时荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV GDr180疫苗株和GD强毒株时敏感性分别达到19.4拷贝/μL和34.2拷贝/μL;该方法与PRRSV其他8个病毒株和猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪细小病毒不发生交叉反应,表明该方法具有良好的特异性;因此可以用于PRRSV GDr180疫苗株与野毒株的鉴别检测. 相似文献
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犬冠状病毒(CCoV)是一种有包膜的RNA病毒,引起犬胃肠道的感染。迄今,CCoV已鉴定出两种不同的基因型,CCoVⅠ型和CCoVⅡ型。近年来,已检测到与传播性胃肠炎病毒有潜在重组起源的CCoVⅡ型毒株(CCoV-Ⅱb),并鉴定为新亚型,以区别于"经典"CCoVⅡ型株(CCoV-Ⅱa)。本研究在两只出现胃肠道症状后死亡的幼犬体内检测出两株CCoV-Ⅱb型病毒。在粪便中检测到两种亚型(CCoV-Ⅱa/Ⅱb)的混合感染,但在脏器中只检测出了CCoV-Ⅱb。同时,检测到幼犬被犬细小病毒2型(CPV2)感染。两株CCoV-Ⅱb毒株均在细胞培养物中分离出,并进行了序列分析和系统发育分析,通过RT-PCR和实时定量PCR的方法,进行了组织分布和病毒载量分析。本研究首次描述了CCoV-Ⅱb毒株在脏器中的组织分布并进行了定量。CCoV-Ⅱa毒株仅在粪便中检测到,提示了在CPV2共感染的犬类动物中,CCoV-Ⅱb毒株与常见的肠道CCoV-Ⅱa型毒株相比,可能在散播上更具优势。 相似文献
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Real—time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒 总被引：2，自引：0，他引：2
为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法.通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高.通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率. 相似文献
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中国蜂蜜主要分为中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜两种,分别由中蜂和意蜂酿造而成。中蜂蜂蜜营养价值高,保健功能好,但是由于产量低,价格是意蜂蜂蜜的3~5倍。一些不法企业和养蜂人趁机将意蜂蜂蜜假冒中蜂蜂蜜销售,或将意蜂蜂蜜掺入到中蜂蜂蜜中以次充好。因此,如何鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜是当前蜂产品行业面临的一大难题。本研究以MRJP2(Major Royal Jelly Protein 2)为靶标基因,分别设计了针对中蜂和意蜂的特异性引物和探针,开发了实时荧光PCR-Taqman探针法,并对该方法的特异性和灵敏度进行了分析。结果显示该方法可以特异性的区分中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜;对意蜂蜂蜜DNA的最低检测限达到0.05ng,对中蜂蜂蜜DNA的最低检测限达到0.01ng;对市售中蜂蜂蜜进行真实性摸底调查发现约37%样品为中蜂蜂蜜,其余样品均含有意蜂蜂蜜成分。综上所述,中蜂蜂蜜掺假现象严重,实时荧光PCR方法检测灵敏度高、特异性强、操作简便快速,可为中蜂蜂蜜掺假问题提供技术支持。 相似文献
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旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。 相似文献
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通过序列比对和Blast分析,选定犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白保守区基因为检测的目的基因,引物采用Primer Premier 5.0软件设计。利用灵敏度较高的TaqMan探针法建立CPV核酸检测方法。通过对标准品的扩增、测序及对标准扩增曲线的绘制,建立CPV核酸检测方法。同时对建立的检测方法进行了检测特异性、灵敏度和重复性分析。将阳性对照标准品进行10倍梯度稀释后可检测到102拷贝/μL样品,表明该检测体系具有较高的检测灵敏度。通过分析表明,本检测方法在用空白对照及类似的猪细小病毒、猪圆环病毒作为扩增对照时,没有发现非特异性产物的产生,表明该体系对于CPV的检测是特异的。通过6次批间重复检测,体系的变异系数小于3%,表明该检测体系具有良好的重复性。 相似文献
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LIU Yi WU Zhi-ming YAN Ruo-qian ZHAO Ming-jun WANG Dong-fang ZHAO Xue-li LIU Mei-fen CHENG Jun-zhen XUE Xiao LI Ning 《中国畜牧兽医》2014,41(6):68-73
In order to establish a TaqMan MGB fluorescent-quantitative PCR (FQ-PCR) assay for detecting canine parvovirus (CPV) specifically, sensitively and rapidly, a highly sensitive and specific TaqMan MGB FQ-PCR assay was developed using the specific primers and TaqMan MGB probe designed basing on the conservative sequences of VP2 gene of CPV in GenBank. The sensitivity, specificity and repetition assay of FQ-PCR assay were tested, and 46 clinic suspicious CPV infected samples were detected by the FQ-PCR assay in contrast to the routine PCR method. The results indicated that the FQ-PCR was successfully established. The developed FQ-PCR assay was able to detect as little as 1×101copies/μL of recombinant pGEX-T/CPV plasmid DNA, and the sensitivity of which was 100 times more than that of the routine PCR. The specificity assay exhibited that positive signals could be obtained from recombinant pGEM-T/CPV plasmid, but not from the genomic DNA or total cDNA of the other 5 kinds of pathogenic microorganism acting as the controls. The repetition tests were carried out by detection repeated 3 times for 3 different concentrations of recombinant pGEX-T/CPV plasmid, and the results indicated that the FQ-PCR was reproducible. Twenty-three positive results from 46 clinic suspicious CPV infected samples were obtained, which showed the better sensitivity than that of the routine PCR, with 19 positive samples from the same 46 suspected samples. The study suggested that the CPV FQ-PCR method was successfully established, and suitable for clinic rapid diagnosing of CPV and early detection of latent infection. 相似文献
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为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。 相似文献
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伪狂犬病病毒野毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据伪狂犬病病毒gE基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病病毒野毒的PCR引物和一条Taqman荧光探针,采用Li ght Cycl e 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1.0×102～1.0×1010拷贝,灵敏度可达4拷贝。检测速度快,仪器的运行时间仅为1 h。对13株猪伪狂犬病病毒野毒进行了检测,结果均为阳性;与伪狂犬病gE基因缺失疫苗、猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好等优点,可望用于临床上伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的区分,伪狂犬病病毒野毒的检测和病毒分布的研究等。 相似文献
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为建立一种简便、快速的针对非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族成员MGF360-12L的分子检测方法,基于MGF360-12L基因序列,设计并合成引物,建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,于35℃恒温反应30 min,即可实现对目的片段的稳定扩增;以含有MGF360-12L基因的重组质粒为模板,RPA反应的检测限达到10~3个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和 PCV-2基因组cDNA或DNA没有扩增。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低,能够为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。 相似文献